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不孕不育患者分离脲原体的分...病学特征及比较基因组学研究_杨婷

时间:2022-05-13来源:EMBA论文

背景与目的: 脲原体(Ureaplasma spp.,UU)是人类泌尿生殖道常见的共生型微生物,常 寄居于人体泌尿生殖道粘膜表面,可引起多种感染性疾病。随着 UU 多位点分型方 案的建立,研究人员对少部分 UU 感染人群进行了分子流行病学研究,并且发现 UU 不同亚组菌株与疾病的关系存在差异。本研究旨在明确 UU 在女性不孕患者和 男性不育患者的克隆分布情况,以及 UU 不同亚组菌株间的基因背景学差异,为 UU 的致病机制研究提供新的思路。 方法: 1. 使用支原体培养试剂盒,分别对浙江大学附属邵逸夫医院确诊的 226 例女 性不孕患者和武警上海市总队医院确诊的 480 例男性不育患者进行 UU 筛查。对 培养阳性的 UU 菌株进行种群鉴定,并对单一感染菌株进行多位点序列分型研究; 比较分析 UU 在女性不孕患者和男性不育患者的分布情况;比较分析男性不育患 者 UU 阴性组和阳性组的精液参数,包括精子浓度、精子总活力、前向运动力、非 前向运动力和不动精子率。 2. 选择菌株 UPA106(属于亚组 A)、UUR132(属于亚组 2)和 UUR315(属 于亚组 1),使用二代 Illumina 和三代 Nanopore 高通量测序技术对三株菌进行基 因组测序。分别选择标准菌株 UPA ATCC 27815 和 UUR ATCC 33699 作为微小脲 原体(Ureaplasma parvum, UPA)和解脲脲原体(Ureaplasma urealyticum, UUR) 的参考菌株,分析三株临床菌株和两株参考菌株的全基因组共线性关系和直系同 源基因簇;分析 UPA106 与 NCBI GenBank 数据库中 14 株 UPA 的单核苷酸多态 II 浙江大学博士学位论文 中文摘要 性;分析 UU132、UUR315 和 NCBI GenBank 数据库中 18 株 UUR 的单核苷酸多 态性;分别分析 15 个毒力因子在三株菌的变异情况。分别选择与三株菌亲缘关系 最近的标准菌株作为参考,进行多带抗原(multiple banded antigen, MBA)家族基 因的共线性比对。使用单克隆抗体 6522 检测三株菌中 MBA 的表达情况,并对蛋 白条带进行质谱检测。使用微量肉汤稀释法研究三株菌对喹诺酮类、四环素类、大 环内酯类、氯霉素类和氨基糖苷类抗生素的耐药情况,并对耐药株进行耐药机制分 析。 结果: 1. 女性不孕和男性不育患者分离脲原体的分子流行病学特征 (1)女性不孕患者中检测到 101 株 UU,其中 85 株 UPA,11 株 UUR,5 株 混合感染株。在 85 株 UPA 中发现 24 个 eST 型,eST16 和 eST41 是优势克隆株; 在 11 株 UUR 中发现 10 个 eST 型,eST82 是优势克隆株。 (2)男性不育患者中检测到 104 株 UU,其中 78 株 UPA,24 株 UUR,2 株 混合感染株。在 78 株 UPA 中检出 32 个 eST 型,eST16 和 eST41 为优势克隆株; 在 24 株 UUR 中共检出 16 个 eST 型,eST82 是优势克隆株。 (3)在女性不孕患者和男性不育患者中,UPA 的检出率均高于 UUR。与男 性不育患者相比,UUR 在女性不孕患者的检出率偏低(P<0.05),并且未检测到 UUR 的亚组 2。 (4)与阴性组相比,精子浓度、总活力和前向运动力在 UU 各亚组呈现不同 的变化趋势,但是差异均没有统计学意义(P>0.05),非前向运动力在 UUR 的亚 组 2 出现明显减低(P<0.05)。 2. 脲原体不同亚组菌株的基因组学特征和比较基因组学分析 (1)UPA106、UUR132 和 UUR315 的染色体均为单个闭合环状结构,基因组 全长在 741,809~853,955bp,GC 含量在 25.5%左右,预测的基因数是 627~699 个。 (2)三株临床菌株和两株标准参考菌株的基因组共线性关系良好。在 5 株菌 株中共有 652 个基因簇,其中 541 个基因簇(82.98%)构成 UU 的核心基因。 III 浙江大学博士学位论文 中文摘要 UPA106、UUR132 和 UUR315 分别与菌株 ATCC 27818、ATCC 27618 和 1000 间 的 SNP 差异最小。 (3)三株菌的谷胱甘肽过氧化物酶编码基因、硫氧还蛋白编码基因和脲酶家 族基因均未检测到错义突变。在 UPA106 和 UUR132 的 O-唾液酸糖蛋白酶编码基 因分别检测到点突变 A661G (I221V)和 G709A (A237T);在 UPA106 的硫氧还蛋白 二硫化物还原酶编码基因中观察到点突变 A425G (Y142C);在 UUR132 的丝氨酸/ 苏氨酸激酶的编码基因观察到点突变 A148G (S50G);在 UPA106、UUR132 和 UUR315 的溶血酶编码基因分别检测到点突变 A55G (I19V)、A981T (K327N)和 A981T (K327N)。 (4)在 UPA106 和菌株 ATCC 27818、UUR132 与菌株 ATCC 27618 的 MBA 家族基因线性比对中均发现,mba 基因的 N 端与基因间区发生了 DNA 倒置。在 UPA106,倒置后的基因与相邻的 A0412 基因产生基因融合,形成 UPA106 的 mba 基因。在 UUR132,倒置后的基因与插入的 0418 基因产生基因融合,形成 UUR132 的 mba 基因。在两菌株 mba 基因的下游均不包含串联重复序列。UUR315 和 ATCC 33696 的 比 对 分 析 发 现 , mba 的 N 端 发 生 了 突 变 , 导 致 翻 译 提 前 终 止 “MKLLKKKSFFFQNTKKQLFS*”。mba(A0418)的 C 端发生了 DNA 倒置,倒 置后的 C 端序列出现在 UUR315 的 02080 基因。在 UUR315 的 02090 基因中发现 了两段包含相同串联重复序列(QAMVQQAQKN)的插入片段。此外,在三株菌 mba 基因两侧的基因均发现了 C 端串联重复数目的变异。单克隆抗体 6522 在 UPA106、UUR132 和 UUR5 中分别检测到 3 个、3 个和 6 个蛋白条带。质谱结果 显示,UPA106 和 UUR132 中分子量最大条带分别对应 01920 基因编码的 MBA 蛋 白和 02045 基因编码的 MBA 蛋白。 (5)UPA106 和 UUR132 对左氧氟沙星耐药,UUR132 对红霉素耐药,三株 菌均对四环素敏感。在 UPA106 的 parE 基因发现点突变 G1343A(R448K),在 UUR132 的 parC 基因发现点突变 C248T(S83L)。在 UUR132 的 L4、L22 和 23S rRNA 基因均未找到耐药相关突变。 IV 浙江大学博士学位论文 中文摘要 结论: 1. UU 在女性不孕患者和男性不育患者中呈现以优势克隆为主的多克隆分布, 优势克隆是 eST16、eST41 和 eST82。 2. 除 MBA 家族基因外,UU 的毒力因子都很保守,尤其是脲酶家族基因。 3. UU 中 MBA 家族基因的突变机制复杂多样。MBA 的保守 N 端可以发生突 变,造成该片段的缺失;MBA 的 N 端和 C 端均可以发生 DNA 倒置突变;mba 基 因座内任何下游包含串联重复序列的基因均可以发生 C 端串联重复数目的突变。 插入突变也是 MBA 的突变机制。
脲原体;女性不孕;男性不育;多位点序列分型;比较基因组学;多带 抗原家族
    背景与目的:脲原体(Ureaplasma spp.,UU)是人类泌尿生殖道常见的共生型微生物,常
寄居于人体泌尿生殖道粘膜表面,可引起多种感染性疾病。随着 UU 多位点分型方
案的建立,研究人员对少部分 UU 感染人群进行了分子流行病学研究,并且发现
UU 不同亚组菌株与疾病的关系存在差异。本研究旨在明确 UU 在女性不孕患者和
男性不育患者的克隆分布情况,以及 UU 不同亚组菌株间的基因背景学差异,为
UU 的致病机制研究提供新的思路。
方法:
1. 使用支原体培养试剂盒,分别对浙江大学附属邵逸夫医院确诊的 226 例女
性不孕患者和武警上海市总队医院确诊的 480 例男性不育患者进行 UU 筛查。对
培养阳性的 UU 菌株进行种群鉴定,并对单一感染菌株进行多位点序列分型研究;
比较分析 UU 在女性不孕患者和男性不育患者的分布情况;比较分析男性不育患
者 UU 阴性组和阳性组的精液参数,包括精子浓度、精子总活力、前向运动力、非
前向运动力和不动精子率。
2. 选择菌株 UPA106(属于亚组 A)、UUR132(属于亚组 2)和 UUR315(属
于亚组 1),使用二代 Illumina 和三代 Nanopore 高通量测序技术对三株菌进行基
因组测序。分别选择标准菌株 UPA ATCC 27815 和 UUR ATCC 33699 作为微小脲
原体(Ureaplasma parvum, UPA)和解脲脲原体(Ureaplasma urealyticum, UUR)
的参考菌株,分析三株临床菌株和两株参考菌株的全基因组共线性关系和直系同
源基因簇;分析 UPA106 与 NCBI GenBank 数据库中 14 株 UPA 的单核苷酸多态
II
浙江大学博士学位论文 中文摘要
性;分析 UU132、UUR315 和 NCBI GenBank 数据库中 18 株 UUR 的单核苷酸多
态性;分别分析 15 个毒力因子在三株菌的变异情况。分别选择与三株菌亲缘关系
最近的标准菌株作为参考,进行多带抗原(multiple banded antigen, MBA)家族基
因的共线性比对。使用单克隆抗体 6522 检测三株菌中 MBA 的表达情况,并对蛋
白条带进行质谱检测。使用微量肉汤稀释法研究三株菌对喹诺酮类、四环素类、大
环内酯类、氯霉素类和氨基糖苷类抗生素的耐药情况,并对耐药株进行耐药机制分
析。
结果:
1. 女性不孕和男性不育患者分离脲原体的分子流行病学特征
(1)女性不孕患者中检测到 101 株 UU,其中 85 株 UPA,11 株 UUR,5 株
混合感染株。在 85 株 UPA 中发现 24 个 eST 型,eST16 和 eST41 是优势克隆株;
在 11 株 UUR 中发现 10 个 eST 型,eST82 是优势克隆株。
(2)男性不育患者中检测到 104 株 UU,其中 78 株 UPA,24 株 UUR,2 株
混合感染株。在 78 株 UPA 中检出 32 个 eST 型,eST16 和 eST41 为优势克隆株;
在 24 株 UUR 中共检出 16 个 eST 型,eST82 是优势克隆株。
(3)在女性不孕患者和男性不育患者中,UPA 的检出率均高于 UUR。与男
性不育患者相比,UUR 在女性不孕患者的检出率偏低(P<0.05),并且未检测到
UUR 的亚组 2。
(4)与阴性组相比,精子浓度、总活力和前向运动力在 UU 各亚组呈现不同
的变化趋势,但是差异均没有统计学意义(P>0.05),非前向运动力在 UUR 的亚
组 2 出现明显减低(P<0.05)。
2. 脲原体不同亚组菌株的基因组学特征和比较基因组学分析
(1)UPA106、UUR132 和 UUR315 的染色体均为单个闭合环状结构,基因组
全长在 741,809~853,955bp,GC 含量在 25.5%左右,预测的基因数是 627~699 个。
(2)三株临床菌株和两株标准参考菌株的基因组共线性关系良好。在 5 株菌
株中共有 652 个基因簇,其中 541 个基因簇(82.98%)构成 UU 的核心基因。
III
浙江大学博士学位论文 中文摘要
UPA106、UUR132 和 UUR315 分别与菌株 ATCC 27818、ATCC 27618 和 1000 间
的 SNP 差异最小。
(3)三株菌的谷胱甘肽过氧化物酶编码基因、硫氧还蛋白编码基因和脲酶家
族基因均未检测到错义突变。在 UPA106 和 UUR132 的 O-唾液酸糖蛋白酶编码基
因分别检测到点突变 A661G (I221V)和 G709A (A237T);在 UPA106 的硫氧还蛋白
二硫化物还原酶编码基因中观察到点突变 A425G (Y142C);在 UUR132 的丝氨酸/
苏氨酸激酶的编码基因观察到点突变 A148G (S50G);在 UPA106、UUR132 和
UUR315 的溶血酶编码基因分别检测到点突变 A55G (I19V)、A981T (K327N)和
A981T (K327N)。
(4)在 UPA106 和菌株 ATCC 27818、UUR132 与菌株 ATCC 27618 的 MBA
家族基因线性比对中均发现,mba 基因的 N 端与基因间区发生了 DNA 倒置。在
UPA106,倒置后的基因与相邻的 A0412 基因产生基因融合,形成 UPA106 的 mba
基因。在 UUR132,倒置后的基因与插入的 0418 基因产生基因融合,形成 UUR132
的 mba 基因。在两菌株 mba 基因的下游均不包含串联重复序列。UUR315 和 ATCC
33696 的 比 对 分 析 发 现 , mba 的 N 端 发 生 了 突 变 , 导 致 翻 译 提 前 终 止
“MKLLKKKSFFFQNTKKQLFS*”。mba(A0418)的 C 端发生了 DNA 倒置,倒
置后的 C 端序列出现在 UUR315 的 02080 基因。在 UUR315 的 02090 基因中发现
了两段包含相同串联重复序列(QAMVQQAQKN)的插入片段。此外,在三株菌
mba 基因两侧的基因均发现了 C 端串联重复数目的变异。单克隆抗体 6522 在
UPA106、UUR132 和 UUR5 中分别检测到 3 个、3 个和 6 个蛋白条带。质谱结果
显示,UPA106 和 UUR132 中分子量最大条带分别对应 01920 基因编码的 MBA 蛋
白和 02045 基因编码的 MBA 蛋白。
(5)UPA106 和 UUR132 对左氧氟沙星耐药,UUR132 对红霉素耐药,三株
菌均对四环素敏感。在 UPA106 的 parE 基因发现点突变 G1343A(R448K),在
UUR132 的 parC 基因发现点突变 C248T(S83L)。在 UUR132 的 L4、L22 和 23S
rRNA 基因均未找到耐药相关突变。
IV
浙江大学博士学位论文 中文摘要
结论:
1. UU 在女性不孕患者和男性不育患者中呈现以优势克隆为主的多克隆分布,
优势克隆是 eST16、eST41 和 eST82。
2. 除 MBA 家族基因外,UU 的毒力因子都很保守,尤其是脲酶家族基因。
3. UU 中 MBA 家族基因的突变机制复杂多样。MBA 的保守 N 端可以发生突
变,造成该片段的缺失;MBA 的 N 端和 C 端均可以发生 DNA 倒置突变;mba 基
因座内任何下游包含串联重复序列的基因均可以发生 C 端串联重复数目的突变。
插入突变也是 MBA 的突变机制。
关键词:脲原体;女性不孕;男性不育;多位点序列分型;比较基因组学;多带
抗原家族
V
浙江大学博士学位论文 Abstract
The molecular epidemiological characteristics and
comparative genomics of Ureaplasma species isolated from
infertile patients
Abstract
Background and objective:
Ureaplasma spp. as commensal bacteria are present on the mucosal surfaces of the
human genitourinary tract and can cause a variety of infectious diseases. The expanded
multilocus sequence typing (eMLST) scheme for Ureaplasma spp. was developed
recently, only a few studies have reported the population distribution of this species with
the new typing method. Moreover, a difference in the relationships between Ureaplasma
subgroups and disease has been revealed. The aim of this study was to use eMLST to
explore the distribution of Ureaplasma spp. in infertile females and males and to
understand the genetic differences between Ureaplasma strains in different subgroups,
which may provide insight into the pathogenicity of Ureaplasma spp.
Methods:
1. A total of 226 vaginal swab samples were obtained from infertile females at Sir
Run Run Shaw Hospital of Zhejiang University and 480 semen samples were obtained
from infertile males at Shanghai Corps Hospital of Chinese People’s Armed Police.
Ureaplasma spp. were identified in all samples using the commercially available
Mycoplasma Kit. U. urealyticum and U. parvum were identified in all broth cultures that
were positive for Ureaplasma spp. The eMLST was performed for single infections of U.
urealyticum or U. parvum. The distributions of Ureaplasma spp. between infertile
VI
浙江大学博士学位论文 Abstract
females and males were analyzed. Semen characteristics, including sperm concentration,
total motility, progressive motility, non-progressive motility and immotile sperm, were
compared between negative group and Ureaplasma sub-groups.
2. Three Ureaplasma strains UPA106 (belonging to sub-group A), UUR132
(belonging to sub-group 2) and UUR315 (belonging to sub-group 1) were chosen. Whole-
genome sequencing was performed using combined HiSeq X10 (Illumina) and MinION
(Nanopore) platforms. Strain ATCC 27815 was regarded as a reference strain for U.
parvum and strain ATCC 33699 was regarded as a reference strain for U. urealyticum.
Multiple genome alignment and whole-genome orthologous clusters of three clinical
strains and two reference strains were performed. The single nucleotide polymorphisms
between UPA106 and known sequenced U. parvum strains in NCBI was performed. The
single nucleotide polymorphisms between UUR132, UUR315 and known sequenced U.
urealyticum strains in NCBI was performed. The fifteen virulence genes were analyzed
between each of the three isolates and the corresponding reference strain. Comparisons
of multiple banded antigen (MBA) loci between UPA106 and ATCC 27818, UUR132
and ATCC 27618, UUR315 and ATCC 33696 were analyzed, respectively. Next, the
MBA proteins of three strains were detected using monoclonal antibody 6522 and were
identified by mass spectrum. Three strains were subjected to antimicrobial susceptibility
testing for levofloxacin, ciprofloxacin, tetracycline, erythromycin, azithromycin,
chloromycetin, and gentamicin using the broth microdilution method. The mechanisms
underlying quinolone and macrolide resistance were determined.
Results:
1. The clonal diversity of Ureaplasma species in infertile females and males
(1) A total of 101 Ureaplasma strains were detected in infertile females, 85 isolates
were U. parvum, 11 isolates were U. urealyticum, the remaining five samples were mixed
species. Except for the five mixed samples, eMLST revealed 24 expanded sequence types
VII
浙江大学博士学位论文 Abstract
(eSTs) in U. parvum strains and 10 eSTs in U. urealyticum strains. Among them, eST16
and eST41 were the most frequent clones in U. parvum and eST82 was the most prevalent
clones in U. urealyticum.
(2) A total of 104 Ureaplasma strains were detected in infertile males, 78 isolates
were U. parvum, 24 isolates were U. urealyticum, the remaining two samples were mixed
species. Except for the two mixed samples, eMLST revealed 32 eSTs in U. parvum strains
and 16 eSTs in U. urealyticum strains. Among them, eST16 and eST41 were the most
frequent clones in U. parvum and eST82 was the most prevalent clones in U. urealyticum.
(3) The distribution of U. parvum was higher than U. urealyticum in infertile females
and males. Compared with infertile males, the distribution of U. urealyticum was lower
in infertile females (P<0.05) and no strains were found in sub-group 2.
(4) The sperm concentration, total motility, and progressive motility in Ureaplasma
sub-groups tended to be lower or higher than in the negative group, but the differences
were without statistical significance (P>0.05). Non-progressive motility in sub-group 2
was statistically significantly lower than in the negative group (P<0.05).
2. Genome features and comparative genomics of three Ureaplasma species from
different Ureaplasma sub-groups
(1) The genomes of UPA106, UUR132 and UUR315 each consisted of a single,
circular chromosome with a low GC content of approximately 25.5%. The genome sizes
of the three strains ranged from 741,809 to 853,955bp. The genes in the three strains
ranged from 627 to 699.
(2) The three clinical strains had significant genomic synteny with the two reference
strains. OrthoVenn analysis revealed 652 clusters among them, with 541 clusters (82.98%) shared among the five strains. Strains UPA106, UUR132 and UUR315 shared the most
similarity with strains ATCC 27818, ATCC 27618 and 1000, respectively.
VIII
浙江大学博士学位论文 Abstract
(3) There was no nonsynonymous mutation in genes encoding glutathione
peroxidase, thioredoxin and urease families of the three strains. UPA106 and UUR132
showed one nonsynonymous variant site of virulence genes encoding O-sialoglycoprotein
endopeptidase, A661G (I221V) and G709A (A237T), respectively. UPA106 showed one
nonsynonymous variation in the gene encoding thioredoxin-disulfide reductase, A425G
(Y142C). UUR132 showed one nonsynonymous variation in the gene encoding
serine/threonine kinase, A148G (S50G). Three nonsynonymous mutations, A55G (I19V),
A981T (K327N) and A981T (K327N), were observed in genes coding for hemolysin in
UPA106, UUR132 and UUR315, respectively.
(4) The comparisons of MBA loci between UPA106 and ATCC 27818, UUR132
and ATCC 27618 revealed DNA inversion events, which occurred between the N-
terminal conserved domain of the mba gene and one flanking intergenic region. The
inverted N-terminal domain was fused with the adjacent gene (A0412), forming an mba
(01920) without the C-terminal repeat region in UPA106. The inverted N-terminal
domain was fused with the insertion gene (0418) forming an mba (02045) without tandem
repeating units in UUR132. The N-terminal sequence of mba mutated in UUR315,
resulting in a stop codon in the 21st amino acid (MKLLKKKSFFFQNTKKQLFS*).
Relative to strain ATCC 33696, UUR315 exhibited an inversion event in the C-terminal
variable domain of mba. Gene (02080) of UUR315 contained the complete C-terminal
domain of mba (A0418) of strain ATCC 33696. Two sequences with identical tandem
repeating unit ‘QAMVQQAQKN’ inserted into a gene (02090) were observed in
UUR315. Moreover, alterations of the number of repeat units in the downstream region
were observed in the flanking genes of mba in the three strains. Monoclonal antibody
6522 recognized three, three and six bands for UPA106, UUR132 and UUR315,
respectively. The upper bands of UPA106 and UPA132 were corresponded MBA, which
was encoded by the gene(01920) in UPA106 and by the gene (02045) in UUR132.
IX
浙江大学博士学位论文 Abstract
(5) UPA106 and UUR132 were resistant to levofloxacin, and UUR132 was also
resistant to erythromycin. Three stains were all sensitive to tetracycline. Two
substitutions, R448K in parE and S83L in parC, were observed in UPA106 and UUR132,
respectively. However, no mutations were found in L4, L22 and 23 rRNA of UUR132.
Conclusions:
1. The distribution of Ureaplasma spp. is high diversity in infertile females and
males, and the main Ureaplasma clones were eST16, eST41 and eST82.
2. The virulence factors of Ureaplasma spp. are conserved, especially for urease-
encoding genes. However, MBA loci show a great variation among different strains.
3. The mechanisms of MBA loci variation are flexible and complex. The conserved
N-terminal domain of the MBA can mutate, resulting in the absence of the typical MBA
sequence. DNA inversion events can occur not only in the N-terminal domain of the MBA,
but also happen in the C-terminal domain of the MBA. Variation in the number of repeat
unit occurs in any genes which containing tandem repeating units in their the C-terminal
domain. Insertion mutation also plays a role in MBA variation.
Key words: Ureaplasma spp.; Infertile females; Infertile males; Expanded Multilocus
Sequence Typing (eMLST); Comparative genome analysis; Multiple-banded antigen
locus
X
浙江大学博士学位论文 中英文缩略词对照
中英文缩略词对照
英文缩写 英文全称 中文全称
UU Ureaplasma spp. 脲原体
UPA Ureaplasma parvum 微小脲原体
UUR Ureaplasma urealyticum 解脲脲原体
MLST Multilocus sequence typing 多位点序列分型
eMLST Expanded multilocus sequence typing 扩展的多位点序列分型
ST Sequence type 序列型
eST Expanded sequence type 扩展序列型
NCBI National Center for Biotechnology
Information 美国国家生物技术信息
中心
ATCC American Type Culture Collection 美国菌种保藏中心
PCR Polymerase Chain Reaction 聚合酶链反应
SNP Single nucleotide polymorphism 单核苷酸多态性
MBA Multiple banded antigen 多带抗原
MIC Minimal Inhibitory Concentration 最小抑菌浓度
CLSI Clinical And Laboratory Standards
Institute 临床和实验室标准化协

LCB Locally collinear block 局部共线块
TRU Tandem repeat unit 串联重复单元
QRDRs quinolone resistance determining regions 喹诺酮类耐药决定区域
CIP Ciprofloxacin 环丙沙星
TET Tetracycline 四环素
LVX Levofloxacin 左氧氟沙星
AZI Azithromycin 阿奇霉素
XI
浙江大学博士学位论文 中英文缩略词对照
英文缩写 英文全称 中文全称
ERY Erythromycin 红霉素
CHL Chloromycetin 氯霉素
GEN Gentamicin 庆大霉素
NGU Non-gonococcal urethritis 非淋菌性尿道炎
CCU Colour Change Unit 颜色变化单位
BPD Bronchopulmonary dysplasia 支气管肺发育不良
NEC Necrotizing enterocolitis 坏死性小肠结肠炎
IgA Immunoglobulin A 免疫球蛋白 A
TLR Toll-like receptors Toll 样受体
XII
浙江大学博士学位论文 目录
目 录
致 谢 .................................................................................................................................I
中文摘要 ..........................................................................................................................II
Abstract........................................................................................................................... VI
中英文缩略词对照 ........................................................................................................XI
正文
前言 .................................................................................................................................. 1
第一部分:女性不孕和男性不育患者分离脲原体的分子流行病学特征研究 .......... 5
引言 .................................................................................................................................. 5
1 材料与方法 .................................................................................................................. 7
1.1 研究对象 ................................................................................................................... 7
1.2 菌株来源 ................................................................................................................... 7
1.3 试剂与仪器 ............................................................................................................... 8
1.4 标本采集 ................................................................................................................... 9
1.5 精液参数指标检测 ................................................................................................... 9
1.6 UU 的培养和冻存 ................................................................................................... 10
1.7 UU 基因组提取 ....................................................................................................... 11
1.8 菌株生物群鉴定 ..................................................................................................... 11
1.9 菌株 eMLST 分型................................................................................................... 11
1.10 PCR 反应................................................................................................................ 12
1.11 PCR 产物电泳和测序............................................................................................ 13
1.12 测序数据分析 ....................................................................................................... 13
1.13 统计分析 ............................................................................................................... 14
2 结果 ............................................................................................................................ 15
2.1 UU 在女性不孕患者的流行分布情况 ................................................................... 15
2.2 UU 在男性不育患者的流行分布情况 ................................................................... 17
2.3 UU 在女性不孕患者和男性不育患者的分布比较 ............................................... 20
2.4 UU 感染与男性不育患者精液参数间的关系 ....................................................... 21
4 小结 ............................................................................................................................ 28
第二部分:脲原体不同亚组菌株的基因组学特征及比较基因组学分析 ................ 29
引言 ................................................................................................................................ 29
浙江大学博士学位论文 目录
1 材料与方法 ................................................................................................................ 31
1.1 菌株来源 .................................................................................................................. 31
1.2 试剂与仪器 ............................................................................................................. 31
1.3 菌株复苏 ................................................................................................................. 35
1.4 固体培养 ................................................................................................................. 35
1.5 挑单克隆 ................................................................................................................. 36
1.6 菌种鉴定 ................................................................................................................. 36
1.7 菌株扩大培养 ......................................................................................................... 37
1.8 基因组提取和二代 Illumina 全基因组测序.......................................................... 38
1.9 三代 Nanopore 全基因组测序 ............................................................................... 39
1.10 全基因组序列拼接 ............................................................................................... 39
1.11 基因组的注释和分析 ........................................................................................... 39
1.12 免疫印迹实验 ....................................................................................................... 41
1.13 质谱检测 ............................................................................................................... 43
1.14 药敏试验 ............................................................................................................... 43
2 结果 ............................................................................................................................ 46
2.1 二代全基因组测序 DNA 样本检测 ...................................................................... 46
2.2 三代全基因组测序 DNA 样本检测 ...................................................................... 47
2.3 基因组的基本信息 ................................................................................................. 48
2.4 共线性关系分析 ..................................................................................................... 52
2.5 同源基因簇分析 ..................................................................................................... 53
2.6 基于 SNP 差异构建系统发育树............................................................................ 54
2.7 毒力基因分析 ......................................................................................................... 58
2.8 药敏结果 ................................................................................................................. 72
3 讨论 ............................................................................................................................ 76
4 小结 ............................................................................................................................ 80
结论和展望 .................................................................................................................... 81
参考文献 ........................................................................................................................ 84
文献综述 ........................................................................................................................ 93
作者简介及在读期间取得的科研成果 ...................................................................... 124
浙江大学博士学位论文 前言
不孕不育患者分离脲原体的分子流行病学特征及比较
基因组学研究
浙江大学医学院 临床检验诊断学
博士研究生 杨婷
导 师 谢鑫友 教授
前言
脲原体(Ureaplasma spp.,UU)是 1954 年首次从男性非淋球菌性尿道炎患者
的尿道分泌物中发现并分离,由于 UU 在固体培养基上形成的菌落微小(5~20μm),
且菌落形态与人型支原体相似,发现最初被命名为 T 型支原体(Tiny-mycoplasmas)
[1]。与其他支原体不同,UU 具有能够分解尿素的脲酶,并且 UU 生长所需 95%的
能量都来源于尿素分解。因为这种独特的脲酶,1974 年 UU 被正式命名为脲原体,
属柔膜纲支原体目支原体科脲原体属 [2]。UU 是人类泌尿生殖道常见的共生型微
生物,大约有 40~80%的性成熟女性子宫颈或阴道粘膜携带 UU,在 16~44 岁健
康男性中 UU 的检出率为 5~15% [3,4]。UU 感染可引起多种疾病,如非淋球菌性尿
道炎,子宫颈炎、子宫内膜炎、绒毛膜羊膜炎、输卵管炎、盆腔炎甚至造成不孕 [5-
8]。倘若在妊娠期感染 UU,还会导致孕妇发生早产、流产等不良妊娠结局 [9-11]。
UU 自孕妇传染给新生儿的几率高达 90% [12],可造成新生儿支气管肺发育不良、
坏死性小肠结肠炎、中枢神经系统损伤等 [13-16],严重影响人类生殖健康和生活质
量。
根据 16S rRNA 序列和 16S-23S rRNA 间区序列的差异,可以将 UU 区分为两
个种群,解脲脲原体(Ureaplasma urealyticum, UUR)和微小脲原体(Ureaplasma
1
浙江大学博士学位论文 前言
parvum, UPA) [2]。UPA 的基因组大小在 0.75~0.78Mbp,UUR 的基因组大小在
0.84~0.95Mbp,两种群菌株基因组 GC 含量均偏低 [17]。根据菌体表面脂蛋白多带
抗原(Multiple banded antigen,MBA)的差异,可以将 UU 区分为 14 种血清型 [18],
其中 UPA 包含血清型 1、3、6 和 14,UUR 包含血清型 2、4、5 和 7~13。随着测
序的发展,不同细菌的多位点序列分型方案(Multilocus sequence typing, MLST)
相继建立。MLST 具有很强的分辨力,能够将同种细菌分为更多的亚型,是细菌分
子流行病学研究的重要方法。2014 年,基于 UU 的 4 个管家基因,ftsH、rpL22、
valS 和 thrS 的 MLST 方案建立 [19]。该方案能够将 UU 的 14 种标准血清型分为 12
个序列型(Sequence type,ST),其中血清型 5 和 8 共同对应 ST7,血清型 9 和 12
共同对应 ST9。为了能够更加准确地区分 UU 的 14 种血清型,研究人员在 MLST
方案的基础上,引入了 2 个 UU 的毒力基因 ureG 和 mba-np1,设计出分辨率更佳
的 MLST 扩展分型方案(Expanded MLST, eMLST) [20]。eMLST 方案能够成功将
UU 的 14 种标准血清型区分为 14 个扩展序列型(Expanded sequence type, eST),
成为了 UU 分子流行病学研究的重要方法。
近些年,研究人员应用 eMLST 分型方法研究了 269 株分离自女性泌尿生殖系
统感染患者和门诊体检健康女性的 UU 菌株,共鉴定出 136 个 eSTs [20]。eMLST 分
型方案研究 UU 在早产、胎膜早破的产妇或新生儿的克隆分布,发现自羊水分离的
50 株 UU 中存在 29 个 eSTs,自脐带分离的 30 株 UU 中存在 22 个 eSTs,自胎盘
分离的 24 株 UU 中存在 18 个 eSTs [21]。研究人员在患尿道炎、前列腺炎、精索静
脉曲张等疾病男性患者分离的 96 株 UU 中,共检出 53 个 eSTs。在 15 对不育夫妇
的 UU 筛查中发现,10 名男性伴侣(66.7%)和 6 名女性伴侣(40.0%)UU 检测
阳性。在男性伴侣检出的 10 株 UU 中发现 8 个 eSTs,在女性伴侣检出的 6 株 UU
中发现 5 个 eSTs [22]。与健康人群相比,UU 在女性不孕患者和男性不育患者的检
出率均明显升高 [23-26]。UPA 是男性不育患者中检出的主要 UU 种群,其中血清型
1(UPA1)和血清型 6(UPA6)是最常见的血清型 [27]。血清型 3(UPA3)和血清
型 14(UPA14)是女性不孕患者中最常见的血清型 [28]。目前,UU 在女性不孕患
2
浙江大学博士学位论文 前言
者和男性不育患者的流行病学研究局限在 2 个种群和 14 种血清型水平,克隆分布
情况尚不清楚。
基于 eMLST 分型方案中 6 个基因串联组成的序列构建系统进化树,依据菌株
间亲缘关系的远近可以将 UPA 细分为 5 个亚组(亚组 A~E),UUR 细分为 2 个
亚组(亚组 1~2)。研究发现,UU 不同亚组菌株的致病性存在差异,其中 UUR
的亚组 2 与阴道炎、输卵管阻塞和宫颈炎等疾病关系密切 [20],UUR 的亚组 1 与
未足月胎膜早破的发生有关 [21]。UU 的致病机制往往与其携带的毒力因子密切相
关。MBA 是存在于 UU 表面的脂蛋白,被认为是 UU 的主要毒力因子。MBA 能够
被宿主细胞的 Toll 样受体识别,通过激活核因子 NF-B,诱导宿主产生促炎细胞
因子 [29]。脲酶也被认为是 UU 的毒力因子,脲酶、氨转运蛋白以及 FoF1-ATP 酶
共同参与 UU 的能量代谢 [30]。UU 的脲酶活性是其他细菌的 30~180 倍 [31],由于
缺乏将氨转化为谷氨酰胺或谷氨酸的酶,脲酶催化尿素分解伴随着大量氨的积累,
会造成 pH 的升高和宿主局部组织的损伤 [32]。此外,UU 潜在的毒力因子还包括
磷脂酶、免疫球蛋白 A 蛋白酶、溶血素、O-唾液酸糖蛋白酶、谷胱甘肽过氧化物
酶、硫氧还蛋白氧化还原酶系统等 [17,33]。
UU 的细胞壁缺乏肽聚糖,对-内酰胺类、万古霉素类、磺胺类抗生素均不敏
感 [34],临床上常使用能够抑制蛋白质合成和 DNA 复制的抗生素来治疗 UU 感染,
此类抗生素包括喹诺酮类、四环素类和大环内酯类 [35]。因为喹诺酮类抗生素的滥
用,我国临床分离的 UU 菌株大多表现为高水平的喹诺酮类耐药 [36]。在南非,UU
则表现出高水平的四环素类和红霉素类抗生素耐药 [37]。细菌的喹诺酮类耐药主要
与发生在 DNA 旋转酶(GyrA 亚基和 GyrB 亚基)和/或拓扑异构酶Ⅳ(ParC 亚基
和 ParE 亚基)的突变有关 [38]。对 UU 而言,发生在 ParC 亚基上的 C248T(Ser83Leu)
突变是最常见的喹诺酮耐药相关突变 [39,40]。UU 的大环内酯类耐药主要与发生在
23S 核糖体 RNA、核糖体蛋白 L4 以及核糖体蛋白 L22 的突变有关 [41]。
UU 的基因组大小在 0.75~0.95Mbp,是除生殖支原体外,全基因组最小,能
够独立复制的微生物。由于 UU 的基因组很小,不携带任何质粒,对外源 DNA 具
3
浙江大学博士学位论文 前言
有严格排他性,常规的基因操作手段并不适用于 UU 毒力研究。2000 年,全球第
一株 UU 的全基因组测序完成,测序菌株为 UU 血清型 3 标准菌株(ATCC 700970),
该菌株基因组全长是 751,719bp,共包含 613 个蛋白编码基因和 39 个 RNA 编码基
因 [33]。迄今,NCBI 基因组计划网站共公布了 14 株 UU 标准血清型菌株和 17 株
临床分离菌株的全基因组数据。与其他微生物相比,UU 的全基因测序菌株数量不
仅少,而且很多菌株的全基因组数据不完整。随着二代、三代高通量测序技术的发
展,对 UU 进行全基因组测序和分析已经成为可能。通过比较基因组学的方法,能
够阐明 UU 不同亚组菌株之间基因组学背景差异,还可能为 UU 致病机制研究和
耐药机制研究提供新的线索。
为明确 UU 在女性不孕患者和男性不育患者的克隆分布,以及 UU 不同亚组
菌株的基因组学特征和基因背景学差异,为鉴定新毒力因子和 UU 的致病机制研
究提供新的思路。本研究分为两部分,第一部分研究了 UU 在女性不孕患者和男性
不育患者的克隆分布情况,并分析了 UU 不同亚组菌株对精液质量的影响。第二部
分研究对三株分别属于 UPA 亚组 A、UUR 亚组 1 和亚组 2 的菌株进行了全基因
组测序,并结合标准菌株序列进行了比较基因组学分析。
4
浙江大学博士学位论文 第一部分 引言
不孕不育患者分离脲原体的分子流行病学特征及比较
基因组学研究
第一部分:女性不孕和男性不育患者分离脲原体的分子流行病学
特征研究
引言
育龄夫妇双方同居一年以上,有正常性生活,没有采用任何避孕措施的情况下,
未能成功怀孕称不孕不育。女性如果不能受孕称为女性不孕症;女性可以受孕但不
能正常完成妊娠,如反复流产等,则称为女性不育症;男性如果不能使伴侣受孕则
统称为男性不育症。
在女性正常生育人群中 UU 的检出率为 8%,而在不明原因的女性不孕患者中
UU 的检出率高达 32% [42]。输卵管疾病是导致女性不孕最常见的病因,Piscopo 等
人发现子宫颈 UU 的定植与输卵管疾病引起的不孕有关 [43]。在正常男性人群中
UU 的检出率为 3%,而在男性不育患者中 UU 的检出率为 12% [44]。与 UU 阴性组
相比,UU 阳性组的精子前向运动力和精子活力均明显减 [26]。UU 可以与精子细
胞膜的磺基半乳糖甘油脂受体结合,直接粘附在精子表面 [45]。精子的顶体后区和
中段是 UU 的主要粘附部位 [46]。UU 中的 UreG 蛋白与精子膜蛋白能够产生交叉
反应,宿主产生的特异性抗体会错误识别精子 [47]。UU 还会产生活性氧等有毒化
合物,诱导膜脂质过氧化,造成精子膜流动性和受精能力的降低,从而造成男性不
育 [48]。
自 UU 的 MLST 和 eMLST 分型方案建立以来,仅有一项研究分析了不孕不育
患者中 UU 的克隆分布情况。该研究纳入了 15 对不育夫妇,其中有 10 名男性伴
侣 UU 检测阳性,共发现 8 个 eST 型;有 6 名女性伴侣 UU 阳性,共发现 5 个 eST
5
浙江大学博士学位论文 第一部分 引言
型 [22]。女性不孕患者和男性不育患者中 UU 的克隆分布情况尚不清楚。为明确此
问题,本研究采用 eMLST 方案分别对 96 株自女性不孕患者分离和 102 株自男性
不育患者分离的 UU 菌株进行了分子流行病学研究,并比较了 UU 在女性不孕患
者和男性不育患者的分布,结合男性精液参数研究了 UU 不同亚组对精子质量的
影响。
6
浙江大学博士学位论文 第一部分 材料与方法
1 材料与方法
1.1 研究对象
1.1.1 研究对象
2016 年 3 月至 2016 年 5 月,在浙江大学附属邵逸夫医院不孕不育门诊确诊的
226 例女性不孕患者,其中 101 例 UU 检测阳性患者,125 例患者 UU 检测阴性。
2014 年 2 月至 2014 年 5 月,在武警上海市总队医院不孕不育门诊确诊的 480 例男
性不育患者,其中 UU 检测阳性患者 104 例,UU 检测阴性患者 376 例。
1.1.2 入选标准
女性不孕者:育龄夫妇双方同居一年以上,性生活正常,未采取任何避孕措施
的情况下,排除男方不育因素,未能成功受孕者。
男性不育者:育龄夫妇双方同居一年以上,性生活正常,未采取任何避孕措施
的情况下,排除女方不孕因素,未能使伴侣成功受孕者。
1.1.3 排除标准
女性不孕者排除:(1)生殖系统器质性病变;(2)性激素分泌异常;(3)
2 周内抗生素使用者。
男性不育者排除:(1)生殖系统器质性病变;(2)性激素分泌异常;(3)
性功能障碍;(4)无精症;(5)家族性遗传病史者;(6)抗精子抗体阳性者;
(7)其他生殖道感染性疾病患者;(8)严重吸烟者、酗酒者、长期接触放射性或
化学毒物者;(9)服用抗癫痫或抗肿瘤药物者;(10)2 周内抗生素使用者。
1.2 菌株来源
在浙江大学邵逸夫医院共收集 101 株 UU,分离自女性不孕患者来源的阴道棉
拭子标本;在武警上海市总队医院共收集 104 株 UU,分离自男性不育患者的精液
标本。
7
浙江大学博士学位论文 第一部分 材料与方法
1.3 试剂与仪器
1.3.1 主要试剂
支原体培养、鉴定、计数及药敏试验试剂盒(法国梅里埃公司)
支原体分离、培养、鉴定、药敏试剂盒(众爱生河北生物科技有限公司)
氯化钾粉剂(上海生工生物工程有限公司)
氯化镁粉剂(上海生工生物工程有限公司)
三羟甲基氨基甲烷粉剂(Tris)(上海生工生物工程有限公司)
吐温-20(上海生工生物工程有限公司)
蛋白酶 K(上海生工生物工程有限公司)
普通琼脂糖凝胶粉(上海生工生物工程有限公司)
2 Taq Master Mix(南京诺唯赞生物科技有限公司)
DL2,000 DNA marker(大连 TaKaRa 公司)
5 Loading Buffer(大连 TaKaRa 公司)
GelRed 原液(北京聚合美生物科技有限公司)
TAE(50)(碧云天公司)
引物(上海生工生物工程有限公司合成)
1.3.2 试剂配置方法
1) 1mol/L KCl 溶液:称取 3.7275g KCl,加入 ddH20 溶解,定容至 50mL,高
压灭菌。
2) 1mol/L MgCl2 溶液:称取 10.165g MgCl2,加入 ddH20 溶解,定容至 50mL,
高压灭菌。
3) 1mol/L Tris-HCl 缓冲液(PH = 8.0):称取 12.114g Tris,加 ddH2O 定容
至 80mL,加 HCl 至 pH = 8.0,再加 ddH2O 定容至 100mL,高压灭菌。
4) 0.5%吐温-20:取 0.5mL 吐温-20,加 ddH2O 定容至 100mL。
8
浙江大学博士学位论文 第一部分 材料与方法
5) UU 裂解液:取 1mol/L KCl 溶液 5.0mL,1mol/L MgCl2 溶液 0.25mL,
1mol/L Tris-HCl 缓冲液(pH = 8.0)1.5mL,0.5%吐温-20 取 2.5mL,加
ddH2O 定容至 100mL。
6) 1TAE:取 20mL TAE(50 ), 加 ddH2O 定容至 1000mL。
7) 1%琼脂糖凝胶:称取 1g 琼脂糖凝胶粉,加入 100mL(1)TAE,微波炉
加热至琼脂糖融化,待适度冷却后,倾倒于制胶模具。
1.3.3 仪器设备
电热恒温培养箱(上海精宏实验设备有限公司)
-80℃冰箱(Thermo 公司)
4℃及-20℃冰箱(三星公司)
恒温金属浴(杭州博日科技有限公司)
电热恒温水槽(上海精宏实验设备有限公司)
PCR 仪(美国 ABI 公司)
电泳仪及凝胶成像仪(美国伯乐公司)
测序仪(Applied Biosystems 公司的 3730XL 测序仪)
全自动精子质量分析仪(以色列 Medical Electronic Systems 公司)
1.4 标本采集
女性:采集标本前,清洁阴道口分泌物后,用无菌拭子深入宫颈口 2~3cm,
轻轻转动后取出,立即放入无菌试管中送检。
男性:采集标本前,要求禁欲 3~7 天。以手淫方式采集精液于干燥消毒容器
内,全程应避免尿液污染,立即送检,置 37℃水浴箱内液化。每个标本分为两份,
一份用于精液常规检测分析,一份用于 UU 的鉴定和培养。
1.5 精液参数指标检测
9
浙江大学博士学位论文 第一部分 材料与方法
采用以色列 SQA-V 全自动精子质量分析仪进行精子浓度和精子活动参数的测
定,按照仪器说明书进行操作。具体步骤如下:
1) 开机,启动机器自动校准和自测功能;
2) 开启与机器建立了链接的电脑,启动 V-Sperm GOLD version 3.60 软件,
设置系统默认值;
3) 选择已知浓度的 QwikCheck beads 进行质控;
4) 输入受检测者的个人和样品信息;
5) 进行样品检测,获得精子检测参数。
1.6 UU 的培养和冻存
采用法国梅里埃公司的 Mycoplasma IST2 一体化试剂盒或众爱生河北生物科
技有限公司的支原体分离、培养、鉴定、药敏试剂盒进行 UU 的培养和鉴定。严格
遵照试剂盒说明书进行操作,具体步骤如下:
1) 将培养基 R1 和 R2 进行混合;
2) 将女性生殖道拭子放入混合后的培养基中,充分搅拌;将 100µL 男性精液
标本加入混合后的培养基后,充分混匀;
3) 用一次性吸管将加有样品的培养基依次加入检测板上的各个检测孔内,每
孔加样 50µL,再分别加一滴石蜡油进行密封,盖上盖子;
4) 将接种的检测板和剩余的接种培养基一同置于 37˚C 孵箱培养 24~48h,
观察颜色变化;
5) 检测板结果判定:UU 生长孔不变色,说明 UU 呈阴性;UU 生长孔变色,
且只有≤104 CCU 孔变色,说明 UU 呈阳性且其数量级≤104 CCU;UU 生
长孔变色,且≤104 CCU 和≥104 CCU 两孔均变色,说明 UU 呈阳性且其数
量级≥104 CCU;
6) 当 UU 呈阳性,剩余的接种培养基颜色变为橘红色时,立即以 1 : 5 的比
例用液体培养基进行继续传代培养;
10
浙江大学博士学位论文 第一部分 材料与方法
7) 增菌培养后,置于-80˚C 冰箱保存备用。
1.7 UU 基因组提取
1) 取 1mL UU 菌液到 1.5mL 高压灭菌的 EP 管内,12,000g 离心 10 分钟,弃
去上清;
2) 加入 50µL UU 裂解液和 1µL 蛋白酶 K,置于 55˚C 水浴箱孵育 1~2h;
3) 95˚C 加热 10min,10,000g 离心 3min,取上清至 0.5mL 高压灭菌的 EP
管,-20˚C 储存待用。
1.8 菌株生物群鉴定
两对引物用于区分 UU 生物群,UPA 和 UUR,序列如下:
表 1.1 UU 生物群鉴定引物
引物名称* 引物序列(5’→3’)
UU295-F GCCAAGAAAACATTTAATCGCT
UU295-R CTGATATTGTCCGCTGCTCATT
UUR10_0588-F AAAGTTAAAGAGTCTTGGTGGA
UUR10_0588-R AATAGGTAATGACCTCTTTGAT
注:*F:正向引物;R:反向引物。
1.9 菌株 eMLST 分型
六对引物用于 UU 的 eMLST 分型 [20],序列如下:
11
浙江大学博士学位论文 第一部分 材料与方法
表 1.2 UU 的 eMLST 分型所用引物
引物名称* 引物序列(5’→3’)
ftsH-F TAAAAAAGACGACTTAACTCAACC
ftsH-R AATAAAGAGTCGCTTTGTGCT
rpL22-F TCCAACAATGAAAAGAACACT
rpL22-R TTTTCCTTCATAGTAAGCATC
valS-F GTCTCAAGAATGATGAACTTTAGCC
valS-R GCAACAACTAGATTATATTTATCC
thrS-F TGATACTGTTATTACGCCTATA
thrS-R AGCGGTAAAATACCTTTAGTTTGTT
ureG-F TTAATTATTGGTGTAGGTGGACCTG
ureG-R TCAATTCAATCAGCAACAGAT
mba-np1-F TAGCGGATTTATCGGTTGAACTATA
mba-np1-R TTAGTTTCAGCACGCCAACCATC
注:*F:正向引物;R:反向引物。
1.10 PCR 反应
1) 反应体系如下:
2Taq Master Mix 25µL
正向引物(10 pmol/µL)1µL
反向引物(10 pmol/µL)1µL
DNA 模板 2µL
ddH2O 21µL
2) 反应条件:
12
浙江大学博士学位论文 第一部分 材料与方法
95℃预变性 5min
95℃变性 30s
55℃退火 30s 35 个循环
72℃延伸 50s
72℃延伸 10min
12℃保持
*退火温度应依据各引物的 Tm 值做出相应调整以期达到最大扩增量。
1.11 PCR 产物电泳和测序
1) 将 1µL 的 5loading buffer 和 4µL 的 PCR 产物或 3µL 的 DNA marker 在上
样板上混匀后,加入到 1%的琼脂糖凝胶上样孔内;
2) 电压 120V,电泳 20min;
3) 用凝胶成像仪拍照,记录电泳结果;
4) 将电泳阳性样本送上海铂尚生物技术有限公司,用 Applied Biosystems 公
司的 3730XL 测序仪进行双向测序。
1.12 测序数据分析
1.12.1 eMLST 分析
测序得到的上下游序列和峰图文件,经 Chromas 及 Seqman 软件分析,得到完
整 的 拼 接 序 列 。 将 拼 接 有 效 的 序 列 放 在 UU 的 MLST 数 据 库
(https://pubmLst.org/ureaplasma/)上进行比对,得到每个管家基因的等位基因号。若
所得测序序列与数据库中的模板不完全匹配,需再次进行 PCR 测序,确定无误后
可认为是新的等位基因型。
1.12.2 系统发育树
13
浙江大学博士学位论文 第一部分 材料与方法
将 eMLST 分型方案中的 6 个基因按照 ftsH-rpL22-valS-thrS-ureG-mba-np1 的
顺序串联排列成等位基因谱(共 2814bp),使用 MEGA 7.0 软件,选择 bootstrap
method,设置 bootstrap 值为 1000 进行系统发育树的构建。
1.13 统计分析
采用 SPSS 软件 23.0 进行数据分析,UU 在女性不孕患者和男性不育患者的分
布比较分析采用 Chi-square 检验。男性精液检测结果以平均值(标准偏差)和范围
(中位数)的形式表示。采用 Kruskal-Wallis 检验和 Mann-Whitney U 检验分别比
较分析 UU 阳性的 7 个亚群和 UU 阴性组的精液参数。P<0.05 有统计学意义。
14
浙江大学博士学位论文 第一部分 结果
2 结果
2.1 UU 在女性不孕患者的流行分布情况
2.1.1 种群分析
在 101 株分离自女性不孕患者的 UU 菌株中,共检出 85 株 UPA(84.16%),
11 株 UUR(10.89%),以及 5 株 UPA、UUR 混合感染株(4.95%)。
2.1.2 eST 型分析
剔除 5 株混合感染 UU,在剩余的 96 株单一感染菌株中,eMLST 分型方案共
检测到 34 个 eST 型,其中新发现 eST 型是 18 个(eST233~eST250)。在 85 株
UPA 中共检测到 24 个 eST 型,其中 eST16 和 eST41 是最常见的克隆株,均见于
21 株 UPA。在 11 株 UUR 中共检测到 10 个 eST 型,其中 eST82 是常见的 eST 型,
见于 2 株 UUR(表 1.3)。
表 1.3 女性不孕患者分离的 96 株脲原体的克隆分布情况
ftsH rpL22 valS thrS ureG mba-np1 eSTs 菌株数
1 2 1 1 3 2 41 21
1 2 1 1 3 38 236* 1 1 1 1 1 1 1 1 2 1 1 1 1 2 1 16 21
1 1 31 1 1 1 233* 1
1 1 1 1 15 1 234* 1
1 1 1 30 2 1 235* 1 1 1 1 1 2 13 18 1
UPA 15 1 1 1 1 2 174 2
33 1 1 1 1 1 249* 1
 2 1 1 1 2 2 2 1
2 1 1 8 2 2 74 10
2 1 1 15 2 2 195 4
2 2 1 1 2 2 4 2 2 1 1 2 2 7 192 1
2 1 1 8 2 53 237* 1
2 1 1 8 2 55 238* 1
15
浙江大学博士学位论文 第一部分 结果
ftsH rpL22 valS thrS ureG mba-np1 eSTs 菌株数
 2 2 1 1 2 56 239* 1
 2 2 1 1 2 58 240* 1
13 1 9 1 2 7 113 2
UPA 8 1 1 1 1 1 172 6
35 1 1 1 2 2 142 1
 6 3 1 1 2 28 247* 1
10 9 1 1 2 6 248* 1
4 3 4 4 5 6 82 2
4 3 2 21 5 6 241* 1
4 3 4 1 5 7 242* 1
4 3 4 1 5 29 243* 1
UUR 4 3 4 4 5 29 163 1
5 3 30 8 5 54 245* 1
5 3 4 5 5 6 9 1
5 3 4 1 5 7 244* 1
6 3 4 1 5 6 246* 1
42 3 4 4 5 57 250* 1
注:*新发现 eST 型。
2.1.3 系统进化关系分析
邻接树显示了 96 株单一感染 UU 菌株间的系统进化关系(图 1.1)。从菌株进
化关系上可以看出,96 株 UU 被分为 2 个克隆复合体,分别为克隆复合体 1 群(共
包含 85 株 UU,24 个 eST 型)与克隆复合体 2 群(共包含 11 株 UU,10 个 eST
型)。两个克隆复合体与 UU 两个种群(UPA 与 UUR)的分类高度一致,即克隆
复合体 1 群对应 UPA,克隆复合体 2 群对应 UUR。
依据菌株亲缘关系的远近,对两个克隆复合体内部菌株进一步分组发现,克隆
复合体 1 群可以分为 5 个亚组 A~E。亚组 A、B、C、D、E 分别包含 22 株、30 株、
24 株、7 株、2 株 UU 菌株,并且分别包含 2 个、8 个、10 个、2 个、2 个 eST 型。
克隆复合体 2 群仅包含 1 个亚组,该亚组共包含 11 株 UU 和 10 个 eST 型。
16
浙江大学博士学位论文 第一部分 结果
图 1.1 96 株自女性不孕患者分离脲原体菌株的系统发育树。菌株名(F1~F96)
和各菌株对应的 eST 型分别标注在每个分支顶部。
2.2 UU 在男性不育患者的流行分布情况
2.2.1 种群分析
在男性不育患者分离的 104 株 UU 中,检出 78 株 UPA(75.00%),24 株 UUR
(23.08%),2 株(1.92%)UPA、UUR 混合感染菌株。
2.2.2 eST 型分析
剔除 2 株混合感染 UU,在 102 株单一感染菌株中,eMLST 分型共检测到 48
个 eST 型,其中 27 个新发现 eST 型(eST186~eST212)。在 78 株 UPA 中共检测
到 32 个 eST 型,其中 eST16 和 eST41 为最常见的克隆株,分别见于 20 株和 12 株
17
浙江大学博士学位论文 第一部分 结果
UPA。在 24 株 UUR 中共检测到 16 个 eST 型,其中 eST82 是最常见克隆株,见于
5 株 UUR(表 1.4)。
表 1.4 男性不育患者分离的 102 株脲原体的克隆分布情况
ftsH rpL22 valS thrS ureG mba-np1 eSTs 菌株数
1 1 1 2 3 2 3 2
1 1 1 1 1 2 15 2
1 1 1 1 2 2 17 3
 1 2 1 1 3 2 41 12
31 2 1 1 3 2 138 1 15 1 1 1 1 2 174 1
 1 1 1 2 3 47 187* 1
 1 21 1 1 3 2 190* 1
52 2 1 1 3 2 209* 1
54 1 1 1 1 2 211* 1
 1 1 1 1 1 1 1 5 1 1 1 1 2 1 16 20 1 2 1 1 3 1 40 1
1 1 1 1 2 45 186* 1
1 1 27 1 2 1 188* 1
UPA 9 18 1 1 1 1 203* 1
2 2 1 1 2 2 4 1
2 1 1 8 2 2 74 4
13 1 9 1 2 7 113 2
 2 1 9 1 2 7 159 1
 2 1 1 2 2 2 191* 1
 2 1 1 2 2 7 192* 2
 2 1 1 2 2 44 193* 1
 2 1 1 2 2 48 194* 1
 2 1 1 15 2 2 195* 1
 2 1 1 25 2 2 196* 1
 2 1 1 26 2 7 197* 1
53 1 1 1 14 42 210* 1
 8 1 1 1 1 1 172 2
 8 1 1 1 2 46 202* 2
35 1 1 24 13 2 205* 1
 4 1 1 1 2 1 198* 2
18
浙江大学博士学位论文 第一部分 结果
ftsH rpL22 valS thrS ureG mba-np1 eSTs 菌株数
5 3 4 5 5 6 9 1
4 3 4 4 5 6 82 5
5 3 4 11 5 6 90 1
6 3 4 4 5 1 94 1
6 3 4 11 5 10 97 1 6 3 4 4 5 6 147 3
4 3 4 4 5 29 163 1
UUR 4 19 4 4 5 29 199 1 *
6 3 4 4 5 10 200 1 *
6 20 4 4 5 6 201 1 *
42 3 2 18 5 29 206* 2
42 3 2 18 5 39 207* 1
42 3 4 4 5 6 208* 2
1 3 4 4 5 6 189 1 *
11 3 4 11 5 43 204* 1
55 3 4 11 5 10 212* 1
注:*新发现 eST 型。
2.2.3 系统进化关系分析
邻接树显示了 102 株单一感染 UU 菌株间的进化关系(图 1.2)。从菌株进化
关系上可以看出,102 株 UU 被分为 2 个克隆复合体,分别为克隆复合体 1 群(共
包含 78 株 UU,32 个 eST 型)和克隆复合体 2 群(共包含 24 株 UU,16 个 eST
型)。与女性不孕患者中分析结果一致,克隆复合体 1 群对应 UPA,克隆复合体
2 群对应 UUR。
依据菌株亲缘关系远近,克隆复合体 1 群被进一步分为 5 个亚组,亚组 A~E。
亚组 A、B、C、D、E 分别包含 25 株、29 株、17 株、5 株、2 株 UU 和 10 个、6
个、12 个、3 个、1 个 eST 型。克隆复合体 2 群被进一步分为 2 个亚组,亚组 1~
2。亚组 1、2 分别包含 21 株、3 株 UU 和 13 个、3 个 eST 型。
19
浙江大学博士学位论文 第一部分 结果
图 1.2 102 株自男性不育患者分离脲原体的系统发育树。菌株名(P1~P102)和
各菌株对应的 eST 型均标注在每个分支顶部。
2.3 UU 在女性不孕患者和男性不育患者的分布比较
在 101 株自女性不孕患者分离的 UU 中,共检出 85 株 UPA(84.16%)和 11
株 UUR(10.89%);在 104 株自男性不育患者分离的 UU 中,共检出 78 株 UPA
(75.00%)和 24 株 UUR(23.08%)。无论是在女性不孕患者还是男性不育患者,
UPA 的检出率均高于 UUR。与女性不孕患者相比,在男性不育患者中 UPA 的检
出率偏低,然而 UUR 的检出率偏高,该差异有统计学意义(P<0.05)(表 1.5)。
20
浙江大学博士学位论文 第一部分 结果
表 1.5 脲原体不同种群在女性不孕患者和男性不育患者的分布比较
性别 UPA UUR
女性 85 11
男性 78 24
P 0.026
自女性不孕患者和男性不育患者分离的 UPA 菌株集中分布在 A、B、C 三个
亚组,其中亚组 B 包含的菌株数最多;自女性不孕患者和男性不育患者分离的 UUR
菌株集中分布在亚组 1。虽然各亚组包含的菌株数在女性不孕患者和男性不育患者
间存在差异,但是差异不具有统计学意义(P>0.05)(表 1.6)。
表 1.6 脲原体不同亚组在女性不孕患者和男性不育患者的分布比较
性别 UPA UUR
亚组 A 亚组 B 亚组 C 亚组 D 亚组 E 亚组 1 亚组 2
女性 22 30 24 7 2 11 0
男性 25 29 17 5 2 21 3
*P 0.792 0.665 0.148 0.481 1.000 0.081 0.248
注:*P 值由各亚组菌株数与剩余所有菌株数进行比较。
2.4 UU 感染与男性不育患者精液参数间的关系
28 例患者因患有严重的少精子症,无法获得精液检测参数,其中 15 例属于阴
性对照组,13 例属于 UU 阳性组。共有 361 例 UU 阴性患者和 89 例 UU 阳性患者
的精液检测值纳入分析。在 UU 阳性患者中,亚组 A~E 分别包含 21 例、29 例、
14 例、4 例、2 例患者,亚组 1~2 分别包含 17 例和 2 例患者(表 1.7)。纳入患
者的年龄在阴性对照组和 UU 不同亚组间不存在统计学差异(P>0.05)。与阴性组
相比,亚组 A、C、D、E 以及亚组 1 的精子浓度偏低,而亚组 B 和亚组 2 的精子
浓度偏高,但是差异没有统计学意义(P>0.05)。与阴性组相比,精子总活力与前
向运动力在亚组 B、C、E 和亚组 1 略微升高,而在亚组 A、D 略微降低,在亚组
2 出现明显的减低,但差异均无统计学意义。亚组 2 的精子总活力均值和前向运动
21
浙江大学博士学位论文 第一部分 结果
力均值分别为 20.75%和 15%,仅接近参考值下限的一半(分别为 40%和 32%)。
与阴性组相比,非前向运动力在亚组 2 出现明显减低,差异具有统计学意义
(P<0.05)。
22
浙江大学博士学位论文 第一部分 结果
表 1.7 脲原体不同亚组与精液检测值之间的关系分析
精液参数 阴性组 UPA UUR
亚组 A 亚组 B 亚组 C 亚组 D 亚组 E 亚组 1 亚组 2 #P
纳入患者数 361 21 29 14 4 2 17 2
年龄
均值(标准差) 32.13 (5.90) 31.29 (6.32) 29.62 (3.25) 32.50 (5.53) 38.50 (7.19) 29.50 (0.71) 30.41 (4.64) 31.00 (1.41)
最大值~最小值
(中位数) 21.00~60.00
(31.00) 19.00~46.00
(30.00) 25.00~36.00
(29.00) 26.00~47.00
(30.50) 33.00~49.00
(36.00) 29.00~30.00
(29.50) 23.00~40.00
(30.00) 30.00~32.00
(31.00) 0.118
精子浓度
(×106/mL)
均值 (标准差) 85.56 (58.41) 78.88 (67.54) 87.09 (68.40) 52.73 (34.60) 63.48 (58.32) 80.95 (21.00) 75.33 (59.35) 111.00
(50.49)
最大值~最小值
(中位数) 1.00~342.30
(76.00) 2.00~209.30
(59.70) 2.00~280.40
(71.30) 8.00~120.40
(46.00) 6.80~143.10
(52.00) 66.10~95.80
(80.95) 5.60~234.10
(67.30) 75.30~146.7
(111.00) 0.423
精子总活力(%)
均值 (标准差) 44.31 (16.78) 40.64 (17.20) 47.03 (19.06) 50.94 (14.63) 44.20 (14.94) 46.45 (1.34) 52.61 (19.83) 20.75 (11.38)
最大值~最小值
(中位数) 0.40~96.70
(45.70) 5.30~68.60
(42.10) 1.20~96.40
(48.80) 18.80~74.40
(52.35) 30.90~65.60
(40.15) 45.50~47.40
(46.45) 18.90~96.80
(52.80) 12.70~28.80
(20.75) 0.201
前向运动(%)
23
浙江大学博士学位论文 第一部分 结果
精液参数 阴性组 UPA UUR
亚组 A 亚组 B 亚组 C 亚组 D 亚组 E 亚组 1 亚组 2 #P
均值 (标准差) 32.44 (15.57) 29.47 (16.44) 34.56 (18.24) 33.55 (14.31) 25.70 (17.60) 36.60 (4.10) 38.94 (21.41) 15.00 (12.16)
最大值~最小值
(中位数) 0.00~84.80
(34.70 ) 0.30~57.90
(32.90) 1.20~84.80
(32.60) 7.40~54.80
(32.75) 1.50~43.60
(28.85) 33.70~39.50
(36.60) 0.00~86.00
(42.30) 6.40~23.60
(15.00) 0.603
非前向运动(%)
均值 (标准差) 11.89 (6.15) 11.17 (6.49) 12.47 (7.09) 17.39 (11.24) 18.50 (8.85) 9.85 (2.76) 13.66 (7.58) 5.75 (0.78)
最大值~最小值
(中位数) 0.40~40.90
(10.40) 4.20~26.30
(8.60) 0.00~34.60
(11.10) 6.00~44.30
(12.20) 10.90~29.40
(16.85) 7.90~11.80
(9.85) 6.60~39.30
(10.80) 5.20~6.30
(5.75) 0.046
*P (VS 阴性组) 0.277 0.578 0.051 0.072 0.720 0.210 0.045
不动精子率(%)
均值 (标准差) 55.67 (16.81) 59.36 (17.20) 52.97 (19.06) 49.06 (14.63) 55.80 (14.94) 53.55 (1.34) 47.39 (19.83) 79.25 (11.38)
最大值~最小值
(中位数) 3.30~99.60
(54.30) 31.40~94.70
(57.90) 3.60~98.80
(51.20) 25.60~81.20
(47.65) 34.40~69.10
(59.85) 52.60~54.50
(53.55) 3.20~81.10
(47.20) 71.20~87.30
(79.25) 0.201
注:#P 使用 Kruskal-Wallis 检验计算得出,*P 使用 Mann-Whitney U 检验计算得出。
24
浙江大学博士学位论文 第一部分 讨论
3 讨论
UU 是人类泌尿生殖道常见的共生型微生物,UU 感染对人类生殖系统造成的
不良影响一直存有争议 [49]。自 Friberg 等人首次报道,UU 在男性不育患者精液的
检出率(76%)明显高于正常生育人群(19%) [50],一系列有关 UU 对人类生育
能力影响的研究随之开展。研究发现,不育夫妇的 UU 检出率几乎是生育能力正常
夫妇的 2 倍,并且与生育能力正常夫妇相比,UU 在不育夫妇间的检出一致性更高
[26]。在对 53 对不育夫妇进行 UU 检测发现,男性伴侣(13/53,24.5%)的 UU 阳
性率高于女性伴侣(11/53,20.8%)[51]。课题组前期在 15 对不育夫妇中发现,10
名男性伴侣(66.7%)UU 阳性,6 名女性伴侣(40.0%)UU 阳性。对从不育夫妇
检出 UU 进行种群一致性分析发现,仅 UUR 的分布在不育夫妇间存有一致性 [22]。
原因不明性女性不孕患者的 UU 检出率为 32%,而正常生育女性人群的 UU
检出率仅为 8% [42]。但也有报道指出,UU 在女性不孕人群和正常生育人群的检出
率的差异不具有统计学意义 [51,52]。在健康男性中 UU 的检出率为 3%,而在男性
不育患者中 UU 的检出率明显升高达到 12% [24]。Abusarah 等人也发现,男性不育
患者的 UU 检出率(10.8%)高于正常生育男性人群(5.7%) [53]。Zhang 等人进一
步证明,UUR 在男性不育患者(42.7%)的阳性率明显高于正常男性人群(22.2%)
[54]。在本研究中,女性不孕患者的 UU 阳性率为 44.69%,男性不育患者的 UU 阳
性率为 21.67%。因为本研究旨在分析女性不孕患者和男性不育患者中 UU 的克隆
分布情况,没有纳入正常生育对照组,所以无法判断 UU 在这些患者和正常人群的
检出率差异。
在女性不孕患者分离的 96 株单一感染 UU(85 株 UPA,11 株 UUR)中,
eMLST 方案共检测到 34 个 eST 型。在男性不育患者分离的 102 株单一感染(78
株 UPA,24 株 UUR)UU 中,eMLST 方案共鉴定出 48 个 eST 型。结果显示,UU
在女性不孕患者和男性不育患者中呈现多克隆分布。在女性不孕患者和男性不育
患者中,eST16 和 eST41 均是 UPA 的优势克隆株,eST82 均为 UUR 的优势克隆
25
浙江大学博士学位论文 第一部分 讨论
株。研究人员用 eMLST 方案分析 96 株自尿道炎、前列腺炎和精索静脉曲张等疾
病男性患者生殖道分离的 UU 菌株,发现 eST16、eST41 和 eST82 是主要 eST 型
[22]。对 104 株分离自羊水、脐带、胎盘的 UU 菌株分析发现,eST16 和 eST41 是
这三个部位最常见克隆株 [21]。Javier 等人对分离自美国的 30 株 UPA 进行 MLST
分型发现,ST1(eST16 对应的 MLST 分型为 ST1)和 ST56 是最常见的克隆 [55]。
Sarah 等人发现瑞士也存在中国的流行克隆株如 ST1 [56]。这些研究表明,UU 中存
在一些优势克隆,这些克隆能够在不同地区和不同人群中广泛传播。
系统发育树分析结果分别将从女性不孕患者和男性不育患者分离的 UU 菌株
分为两个克隆复合体,克隆复合体 1 群即 UPA,克隆复合体 2 群即 UUR,此研究
结果与之前报道一致 [22,55,56]。在 101 株自女性不孕患者分离 UU 中,克隆复合体
1 群(UPA)包含 85 株 UU(84.16%),克隆复合体 2 群(UUR)包含 11 株 UU
(10.89%)。在 104 株男性不育患者分离 UU 中,克隆复合体 1 群(UPA)包含
78 株 UU(75.00%),克隆复合体 2 群(UUR)包含 24 株 UU(23.08%)。结果
显示克隆复合体 1 群(UPA)是在女性不孕患者和男性不育患者检出的主要生物
群。对克隆复合体 1、2 群菌株进一步分组发现,女性不孕患者不包含 UUR 亚群
的 2 亚组。与其他亚组相比,该亚组菌株被报道与阴道炎、输卵管阻塞和宫颈炎等
疾病关系密切 [20]。比较分析 UU 在女性不孕患者和男性不育患者的分布发现,男
性不育患者中 UUR 的检出率高于女性不孕患者。
UU 感染是否会对精液质量造成不良影响一直存有争议。报道称,与阴性组相
比,UU 阳性组的精子总活力和前向运动力会明显减低 [26]。Huang 等人在 UU 阳
性组不仅观察到精子总活力和前向运动力的减低,还发现正常形态精子率明显低
于阴性组 [57]。Luca 等人发现,UU 阳性组的精子密度和前向运动力均低于 UU 阴
性组 [58]。Liu 等人也观察到 UU 阳性组精子密度的减低 [59]。然而,有一些研究者
发现 UU 感染对精液参数无影响 [60,61]。UU 主要依赖白细胞介导的炎症反应和 ROS
的升高来损伤精子 [48,54,62]。本次研究发现,UUR 亚组 2 的精子总活力和前向运动
力均低于参考值下限。与阴性组相比,非前向运动力在 UUR 亚组 2 出现明显减低
26
浙江大学博士学位论文 第一部分 讨论
(P<0.05)。由于 UUR 亚组 2 的样本量不足,该亚组对精子活动能力的影响还有
待进一步研究。
27
浙江大学博士学位论文 第一部分 结论
4 小结
本部分研究结果表明,UU 在女性不孕患者和男性不育患者中呈现以优势克隆
为主的多克隆分布,eST16 和 eST41 是 UPA 的优势克隆株,eST82 是 UUR 的优
势克隆株。UPA 是女性不孕患者和男性不育患者的主要检出种群,并且 UUR 在男
性不育患者的检出率高于女性不孕患者。
28
浙江大学博士学位论文 第二部分 引言
第二部分:脲原体不同亚组菌株的基因组学特征及比较基因组学
分析
引言
UU 是除生殖支原体外,全基因组最小,能够独立复制的微生物。UU 的基因
组大小在 0.75~0.95Mbp,其中 UPA 的基因组在 0.75~0.78Mbp,UUR 的基因组
在 0.84~0.95Mbp。UPA 大约包含 608 个基因,其中 201 个基因编码假定蛋白;
UUR 大约包含 664 个基因,其中 230 个基因编码假定蛋白 [17]。在 UU 血清型 3 标
准菌株(ATCC 700970)共发现 613 个蛋白编码基因,仅 324 个基因可以在肺炎支
原体和生殖支原体中找到同源基因。与生殖支原体相比,UU 丢失了多个与能量代
谢有关的基因,但 UU 也存在许多其独有的基因,这些基因大多与尿素分解和铁离
子转运相关 [33]。
不同亚组 UU 菌株与疾病的关系存有差异,UU 的致病机制往往与其携带的毒
力因子密切相关。多带抗原(Multiple banded antigen,MBA)是 UU 表面蛋白的组
成部分,被认为是 UU 的重要毒力因子。MBA 是由一段保守的 N 端结构域和一段
高度可变的C端结构域构成,在MBA的C端包含有大量的串联重复单元。Paralanov
等人在 14 株 UU 标准血清型菌株的全基因序列中找到 183 个与 MBA 表达相关的
基因,并因此提出了 MBA 超家族的概念 [17]。脲酶也被认为是 UU 的毒力因子,
在 UU 全基因序列还识别出 7 个脲酶编码基因,分别为 ureA、ureB、ureC、ureD、
ureE、ureF、ureG [33]。UU 的潜在毒力因子包括与抵抗敌对环境有关的基因,如过
氧化物酶编码基因、硫氧还蛋白还原酶系统等。此外,UU 中还存在大量重组酶编
码基因,在某些血清型菌株还发现转座子或转座子残基,以及噬菌体相关蛋白 [17]。
比较基因组学特别适用于分析序列复杂和可变性高的基因,如 UU 的 MBA 家
族基因。通过比较基因组学分析能够明确不同菌株的基因组学背景差异,为寻找新
29
浙江大学博士学位论文 第二部分 引言
毒力因子和致病机制研究提供线索。因为 UU 的全基因序列中包含有大量的串联
重复序列,二代测序技术测序序列偏短通常无法跨越 UU 的串联重复区,导致测序
数据不完整。三代测序技术以超长读长和无 GC 偏向为特点,能够成功解决二代测
序序列短的问题,并且三代测序无需 PCR 扩增,进一步降低了引入错误的可能性。
为明确 UU 不同亚组菌株的基因组学特征和基因背景学差异。本部分研究对
从前一部分研究筛选到的 3 株分别属于 UPA 亚组 A、UUR 亚组 1 和亚组 2 的菌
株进行了二、三代高通量测序,并结合标准菌株序列进行了比较基因组学分析和
MBA 的变异机制研究。此外,对三株菌的耐药情况以及耐药机制进行了研究。
30
浙江大学博士学位论文 第二部分 材料与方法
1 材料与方法
1.1 菌株来源
自第一部分筛选到的三株临床分离 UU,其中 UPA106 属于 UPA 的亚组 A,
UUR132 属于 UUR 的亚组 2,UUR315 属于 UUR 的亚组 1。
1.2 试剂与仪器
1.2.1 试剂
支原体的选择分离固体培养基(众爱生河北生物科技有限公司)
支原体培养、鉴定、计数及药敏试验试剂盒(法国梅里埃公司)
支原体基础肉汤培养基 Difco™ PPLO Broth(美国 BD 公司)
酵母提取物 Yeast Extract, Bacto(美国 BD 公司)
尿素(上海生工生物有限公司)
青霉素(上海生工生物有限公司)
乙酸(上海生工生物有限公司)
胎牛血清(美国 invitrogen 公司)
氯化钾粉剂(上海生工生物工程有限公司)
氯化钠粉剂(上海生工生物工程有限公司)
氯化镁粉剂(BBI 生命科学有限公司)
三羟甲基氨基甲烷粉剂(Tris)(上海生工生物工程有限公司)
吐温-20(上海生工生物工程有限公司)
蛋白酶 K(上海生工生物工程有限公司)
普通琼脂糖凝胶粉(上海生工生物工程有限公司)
酚红(上海生工生物有限公司)
PBS(浙江森瑞生物科技有限公司)
2 Taq Master Mix(南京诺唯赞生物科技有限公司)
31
浙江大学博士学位论文 第二部分 材料与方法
DL2,000 DNA marker(大连 TaKaRa 公司)
5 Loading Buffer(大连 TaKaRa 公司)
GelRed 原液(北京聚合美生物科技有限公司)
TAE(50)(碧云天公司)
SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液(5)(上海生工生物工程有限公司)
10% SDS 溶液(碧云天公司)
1.5M Tris-HCl 溶液(pH 8.8)(康为世纪)
1.0M Tris-HCl 溶液(pH 6.8)(康为世纪)
30% Arc-Bis(丙烯酰胺)(博士德生物技术有限公司)
SDS-PAGE 快速电泳缓冲液(10)(赛默飞世尔科技公司)
SDS-PAGE 转膜缓冲液(10)(上海生工生物工程有限公司)
PVDF 膜 (密理博公司)
无水乙醇(杭州长征化学试剂有限公司)
甲醇(上海麦峰实业有限公司)
三色预染蛋白 Marker(上海雅酶生物科技有限公司)
ECL 化学发光底物(美国伯乐公司)
16S 引物(上海铂尚生物技术有限公司)
DNA 提取试剂盒(QIAamp DNA Mini Kit)(德国 QIAGEN 公司)
UU 单克隆抗体 6522(美国 ViroStat 公司)
环丙沙星(CIP,ciprofloxacin)(美国 Sigma 公司)
左氧氟沙星(LVX,levofloxacin)(美国 Sigma 公司)
四环素(TET,tetracycline)(美国 Sigma 公司)
阿奇霉素(AZI,azithromycin)(美国 Sigma 公司)
红霉素(ERY,erythromycin)(美国 Sigma 公司)
氯霉素(CHL,chloromycetin)(美国 Sigma 公司)
庆大霉素(GEN,gentamicin)(美国 Sigma 公司)
32
浙江大学博士学位论文 第二部分 材料与方法
氢氧化钠(上海生物工程有限公司)
95%乙醇(上海生物工程有限公司)
DMSO(上海生物工程有限公司)
1.2.2 试剂配制
1) UU 裂解液:同第一章。
2) 1%酚红:称取 1g 酚红,加入 ddH2O 溶解,定容至 100mL。
3) UU 培养基:
a. 称取 0.4g 酵母提取物,2.1g 支原体基础肉汤培养基,加入适量 ddH2O
溶解,再加入 1%酚红 200µL,ddH2O 定容至 80mL,经高压灭菌后冷却
至室温;
b. 称取 0.12g 尿素,6~10 万单位的青霉素,加入适量胎牛血清进行溶解;
c. 经 0.22µm 滤膜进行过滤后,加入高压冷却后的培养基;
d. 加入 20mL 胎牛血清,振荡混匀后,测 pH;
e. 加乙酸将 pH 调试至 5.5~6.0。
4) 1%琼脂糖凝胶:同第一章。
5) TBS 溶液(10):称取氯化钠粉末 8.775g ,加入适量 ddH2O 进行溶解,
定容至 90mL,再加入 10mL Tris-HCl 溶液(pH=8.0)。
6) TBST 溶液(1):量 取 100mL 10 TBS 溶液,加 ddH2O 定容至 1000mL,
加入 1mL 吐温-20,混匀后使用。
7) 封闭液:称取 2.5g 脱脂奶粉,加入适量 1 TBST 溶液进行溶解,定容至
50mL。
8) 10%分离胶(5mL):取 1.9mL ddH2O,1.7mL 30%丙烯酰胺溶液,1.3mL
1.5M Tris-HCl 溶液(pH 8.8),50µL 10% SDS 溶液,再加入 50µL 10% 过
硫酸铵溶液,最后加 2µL TEMED,缓慢吹打混匀后,注入放置好的玻片。
33
浙江大学博士学位论文 第二部分 材料与方法
9) 5%浓缩胶(3mL):取 2.1mL ddH2O,0.5mL 30%丙烯酰胺溶液,0.38mL
1.0M Tris-HCl 溶液(pH 6.8),30µL 10% SDS 溶液,再加入 30µL 10% 过
硫酸铵溶液,最后加 3µL TEMED,缓慢吹打混匀后,注入放置好的玻片。
10) 电泳缓冲液(1):量 取 100mL 10电泳缓冲液,加 ddH2O 定容至 1000mL,
混匀后使用。
11) 转膜缓冲液(1):量取 100mL 10转膜缓冲液,加入 200mL 甲醇,加
ddH2O 定容至 1000mL,混匀后使用。
12)NaOH 溶液:称取 4g 氢氧化钠固体,加入适量无菌 ddH2O 溶解,无菌
ddH2O 定容至 100mL。
13)32mg/mL 左氧氟沙星母液:称取左氧氟沙星粉末 320mg,加入 5mL 无菌
ddH2O,逐滴加入 NaOH 溶液至药物完全溶解,加无菌 ddH2O 定容至 10mL。
14)32mg/mL 环丙沙星母液:称取环丙沙星粉末 320mg,加适量无菌 ddH2O
进行溶解,至药物完全溶解,加无菌 ddH2O 定容至 10mL。
15)32mg/mL 四环素母液:称取四环素粉末 320mg,加适量 DMSO 先进行溶
解,至药物完全溶解,加无菌 ddH2O 定容至 10mL。
16)32mg/mL 红霉素母液:称取红霉素粉末 320mg,加适量 95%乙醇先进行
溶解,至药物完全溶解,加无菌 ddH2O 定容至 10mL。
17)32mg/mL 阿奇霉素母液:称取环丙沙星粉末 320mg,加适量无菌 ddH2O
进行溶解,至药物完全溶解,加无菌 ddH2O 定容至 10mL。
18)32mg/mL 氯霉素母液:称取氯霉素粉末 320mg,加适量无菌 ddH2O 进行
溶解,至药物完全溶解,加无菌 ddH2O 定容至 10mL。
19)32mg/mL 庆大霉素母液:称取庆大霉素粉末 320mg,加适量无菌 ddH2O
进行溶解,至药物完全溶解,加无菌 ddH2O 定容至 10mL。
1.2.3 仪器设备
电热恒温培养箱(上海精宏实验设备有限公司)
显微镜(德国徕卡公司)
34
浙江大学博士学位论文 第二部分 材料与方法
离心机(美国 Thermo Scientific 公司)
摇床 MAXQ 420 HP(美国 Thermo Scientific 公司)
-80℃冰箱(美国 Thermo Scientific 公司)
4℃及-20℃冰箱(韩国三星公司)
恒温金属浴(杭州博日科技有限公司)
电热恒温水槽(上海精宏实验设备有限公司)
PCR 仪(美国 ABI 公司)
电泳仪及凝胶成像仪(美国伯乐公司)
NanoDrop2000(美国 Thermo Fisher Scientific 公司)
振荡器(上海精宏实验设备有限公司)
电子天平(瑞士 SANYO 公司)
96 孔板(浙江拱东医疗器械股份有限公司)
1.3 菌株复苏
1) 将冷冻于-80℃的菌液取出,置于冰上融化,待完全融化后,以 1:9 的比
例接种于支原体液体培养基,37℃、5%CO2 条件下培养;
2) 培养 24 小时内,当培养基由橙色变成橙红色或红色时,则继续传代,并
记录传代次数。
1.4 固体培养
1) 将支原体选择分离固体培养基放在 37℃培养箱内预温 5~10 分钟;
2) 吸取 20µL 筛选后的菌液,滴到培养基一端,用接种环将标本均匀涂布于
该区域,再在二、三区依次连续划线。每划完一个区,均对接种环灭菌一
次;
3) 在每个组套内加一片 CO2 发生片;
4) 37℃、5%CO2 条件下培养;
35
浙江大学博士学位论文 第二部分 材料与方法
5) 在培养 24 小时、48 小时、72 小时后,在显微镜下观察;
6) UU 菌落小,圆形棕褐色,并且 UU 生长时培养基由淡浅黄色变成淡浅紫
色。
1.5 挑单克隆
1) 取 10 支 1.5mL Ep 管并于管中分别加入 200µL 梅里埃支原体培养基备用;
2) 将接种的固体平板放置在显微镜载物台上,先低倍镜(10 ×)观察全片,
判定有无 UU 菌落生长;
3) 观察到菌落后,沿接种线将菌落稀疏区移至视野正中处;
4) 转换为高倍镜观察,寻找单个 UU 菌落,并保证该菌落周围无其他 UU 单
菌落;
5) 用接种针刮取目的菌落,然后接种到事先准备的装有 UU 培养基的 Ep 管
内;
6) 每株菌取 5~8 个单克隆菌落,待全部取完后,Ep 管放在 37℃、5%CO2 条
件下培养,
7) 由于接种菌量少,可适当延长观察时间,每 24h 观察一次,记录颜色变化;
8) 当培养基由橙色变成橙红色或红色时,以 1:9 的比例,继续传代;
9) 当培养基再次变为橙红色或红色时,取一部分菌液进行鉴定,另一部分菌
液进行分装冻存。
1.6 菌种鉴定
1.6.1 UU 基因组的提取
1) 取 1mL UU 菌液到 1.5mL 高压灭菌的 EP 管内,12,000g 离心 10 分钟,弃
去上清;
2) 加入 50µL UU 裂解液和 1µL 蛋白酶 K,置于 55˚C 水浴箱孵育 1~2h;
36
浙江大学博士学位论文 第二部分 材料与方法
3) 95˚C 加热 10min,10,000g 离心 3min,取上清至 0.5mL 高压灭菌的 EP
管,-20˚C 储存待用。
1.6.2 16S 引物 PCR
1) 引物序列如下:
16S-27F:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG;
16S-1492R:TACGGYTACCTTGTTACGACTT(C,T=Y)。
2) PCR 扩增体系:
2  Taq Master Mix 25µL
16S-27F(10pmol/µL) 1µL
16S-1492R(10pmol/µL)1µL
DNA 模板 2µL
ddH2O 21µL
3) 扩增条件:
95℃预变性 5min
95℃变性 30s
55℃退火 30s 35 个循环
72℃延伸 50s
72℃延伸 10min
12℃保持
4) PCR 产物电泳和测序
同第一部分。
5) 测序序列分析
将序列放入 NCBI blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov)进行比对,确保分
离得到的菌株是 UU。
1.7 菌株扩大培养
37
浙江大学博士学位论文 第二部分 材料与方法
对成功挑取单克隆的 UU 菌株,进行扩大培养。取一管冻存菌,待菌体溶化
后,加入配制的 500mL UU 培养基,37℃、200rpm 振荡培养 48h。
1.8 基因组提取和二代 Illumina 全基因组测序
采用 QIAamp DNA Mini Kit 试剂盒提取基因组,步骤如下:
1) 培养的 UU 菌液倒入 50mL 离心管内,两两配平后,12,000rpm 离心 35 分
钟,弃去上清;
2) PBS 重悬沉淀,并将沉淀汇集于 2 管,配平后,再次离心,弃上清;
3) PBS 重悬沉淀,分别将 2 管沉淀转移置 2 个 1.5mLEp 管内,配平后,
12,000rpm 离心 15 分钟,弃去上清;
4) 加入 180µL ATL 缓冲液,混匀;
5) 加入 20µL 蛋白酶 K,振荡混匀后,放入 56℃水浴箱 1~3 小时,使菌体
充分裂解;
6) 取出 Ep 管,离心至管壁无水珠后,加入 4µL RNase A(100mg/mL),振
荡混匀,室温放置 2 分钟;
7) 离心至管壁无水珠后,加入 200µL Buffer AL,振荡混匀 15s,放入 70℃
水浴箱 10min;
8) 加入 200µL 无水乙醇,震动混匀 15s,并离心至管壁无水珠;
9) 将上述混合液转移至套有收集管的纯化柱(QIAamp Mini spin column)中,
6000g 离心 1min,弃去滤液;
10)在纯化柱中加入 500µL Buffer AW1,6,000g 离心 1min,弃去滤液;
11)在纯化柱中加入 500µL Buffer AW2,20,000g 离心 3min,弃去滤液;
12)取一只新的 2mL 收集管,套在纯化柱上,20,000g 离心 1min;
13)将纯化柱转移到新的 1.5mL Ep 管,加入 40µL 无菌双蒸水,室温放置 5min
后,6000g 离心 1min;
14)弃去纯化柱,盖紧 Ep 管,使用 Nanopore 2000C 进行 DNA 浓度测定;
38
浙江大学博士学位论文 第二部分 材料与方法
15)将提取的 DNA 放于-20℃冰箱中保存;
16)委托杭州天科生物技术有限公司,进行二代 Illumina 全基因组测序。
1.9 三代 Nanopore 全基因组测序
1)配制 3 × 500mL UU 培养基,然后加入待测菌株,37℃、200rpm 振荡培养
48h;
2)将培养的 UU 菌液倒入 50mL 离心管内,两两配平后,12,000rpm 离心 35
分钟,弃去上清;
3)PBS 洗涤沉淀,并将沉淀汇集于 6 管,配平后,再次离心,弃上清;
4)PBS 重悬沉淀,分别将 6 管沉淀转移置 6 个 1.5mL Ep 管内,配平后,
12,000rpm 离心 15 分钟,弃去上清;
5)将所获菌体放于-20℃冰箱中保存;
6)委托杭州天科生物技术有限公司进行后续基因组提取,并使用纳米孔
(Oxford Nanopore)测序仪进行三代全基因组测序。
1.10 全基因组序列拼接
使用 Unicycler 软件分别对 UPA106、UUR132 和 UUR315 的二代和三代全基
因序列进行拼接。先拼接短 reads 得到连续的拼接序列,再根据长 read 判定短 reads
的最佳拼接方式。
1.11 基因组的注释和分析
1.11.1 基因注释
使用快速注释工具 Rapid Annotation using Subsystem Technology (RAST,
https://rast.nmpdr.org)完成基因组注释。
将拼接好的序列利用 NCBI GenBank 在线提交工具提交,并用 NCBI
Prokaryotic Annotation (PGAP)对基因组进行注释,同时获得 NCBI GenBank
Accession Numbers。
39
浙江大学博士学位论文 第二部分 材料与方法
1.11.2 eMLST 分型
将 UPA106、UUR132 和 UUR315 拼接有效的全基因组序列分别提交到 UU 的
MLST 数据库(https://pubmLst.org/ureaplasma/)上进行比对,得到 6 个管家基因的等
位基因号,再将得到的 6 个基因号输入到 MLST 数据库,得到每株菌的序列型。
1.11.3 共线性关系分析
使用 Mauve 软件对 3 株临床菌株(UPA106、UUR132、UUR315)和 2 株标准
菌株(UPA ATCC 27815 和 UUR ATCC 33699)的全基因组序列进行比较,研究 5
株 UU 菌株基因组间的共线性关系。
1.11.4 直系同源基因簇分析
使用在线工具 OrthoVenn2(http://www.bioinfogenome.net/OrthoVenn/)对 3 株
临床菌株(UPA106、UUR132、UUR315)和 2 株标准菌株(UPA ATCC 27815 和
UUR ATCC 33699)进行全基因组直系同源基因簇(Orthologous clusters)的比较,
鉴定 UU 的核心基因组 (core genome)、附属基因组(accessory genome)以及特有
基因(specific genes)。
1.11.5 单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNP)
从 NCBI Genbank 数据库中下载全部已测序 UU 的全基因序列,其中 UPA 共
15 株,包含 UPA106、UPA ATCC 27815、UPA ATCC 700970、UPA hebnu1229、
UPA hebnu3h04、UPA OMC-P162、UPA SV3F4、UPA hebnu uu3、UPA hebnu3h07、
UPA hebnu3h05、UPA ATCC 27813、UPA ATCC 27818、UPA ATCC 33697、UPA
445a、UPA 1051a;UUR 共 20 株,包含 UUR132、UUR315、UUR ATCC 33699、
UUR ATCC 27618、UUR ATCC 27814、UUR ATCC 33696、UUR ATCC 33698、
UUR ATCC 27816、UUR ATCC 33695、UUR ATCC 27819、UUR 4318、UUR 4155、
UUR ATCC 27817、UUR ATCC 33175、UUR 2033、UUR 2608、UUR 1000、UUR
1000a、UUR 1051、UUR 445。选择 UPA ATCC 27815 的全基因组序列作为 UPA
亚群的参考基因组,UUR ATCC 33699 的全基因组序列作为 UUR 亚群的参考基因
组。使用 CSI phylogeny(https://cge.cbs.dtu.dk/services/CSIPhylogeny/)工具,基于
40
浙江大学博士学位论文 第二部分 材料与方法
各自的参考基因序列,分别对所有 UPA 菌株和 UUR 菌株进行序列比对,找出核
心基因组上的 SNP 位点,再分别连锁这些 SNP 位点对 UPA 菌株和 UUR 菌株进行
多重比对,构建系统发育树。
1.11.6 毒力因子分析
将 UPA106、UUR132 和 UUR315 拼接有效的全基因组序列分别提交至 VFDB
数据库(http://www.mgc.ac.cn/VFs/blast/blast.html),寻找新的毒力因子。
根据文献报道,总结 UU 的全部毒力因子,并选择 UPA ATCC 27815 作为
UPA106 的参考菌株,UUR ATCC 33699 作为 UUR132 和 UUR315 的参考菌株。
使用 MEGA7.0 软件,分别以各个菌株参考菌株毒力因子序列为模板,对三株临床
分离菌株的所有毒力基因进行序列比对分析,寻找突变位点。
根据系统进化树分析结果,选择与 UPA106、UUR132 和 UUR315 亲缘关系最
近的标准菌株作为各菌株的参考菌株,使用 Easyfig 软件分别对三株菌株进行 MBA
基因座分析。
1.12 免疫印迹实验
1.12.1 蛋白提取和预处理
1) 分别将 UPA106、UUR132、UUR315 菌株接种到 50mL 自配 UU 培养基,
37℃、200rpm 振荡培养 48h;
2) 收集培养的菌液,15,000 rpm 离心 30min,弃去上清;
3) PBS 洗涤沉淀,15,000 rpm 离心 30min,弃去上清,重复 2 次;
4) 取 20µL PBS 吹打混匀沉淀;
5) 取 16µL 菌体混合液,再加 4µL 5× loading buffer,95℃煮 10min;
6) 将煮好的蛋白经 3,000g 离心 3min,放置-20℃冰箱储存待用。
1.12.2 SDS-PAGE 电泳
1) 按照试剂配制要求分别配制 10%分离胶和 5%浓缩胶;
41
浙江大学博士学位论文 第二部分 材料与方法
2) 将配制好的胶放入倒有电泳液的电泳槽内,拔掉梳子,按照一定顺序,在
上样空内加入 15µL 样本,至少保留 2 个上样本空加 Marker;
3) 接通电源,电压设置为 80V,电泳 20~30min,待 Marker 跑到分离胶,将
电压切换为 120V,继续电泳至目的蛋白条带分离开。
1.12.3 转膜
1) 取裁剪好的 PVDF 膜,浸入甲醇溶液;
2) 将转膜夹、海绵垫、滤纸放入装有转移液的盘子里,打开夹子并保持水
平,在黑色面垫一层海绵垫,再垫三层滤纸,一手固定滤纸一手用玻棒
擀去气泡;
3) 轻轻地敲开玻璃板并刮去浓缩胶,将分离胶全部盖在滤纸上,再将浸泡
过的 PVDF 膜盖于胶上,保证胶能够被全部覆盖。一手轻轻固定胶一手
用玻棒擀去气泡;
4) 在擀好的膜上,垫三层滤纸并除去气泡,再盖一层海绵垫,最后用夹子
夹牢;
5) 将整个装置放置在装有转膜液的电泳槽内,电泳槽放入装有冰的泡沫盒
内;
6) 接通电源,设定电流为 250mA 转膜 2.5h。
1.12.4 显影
1) 将转膜后的 PVDF 膜放于封闭液中,慢摇封闭 1h;
2) 用 TBST 清洗膜几次,标记目的蛋白位置并剪膜;
3) 将剪好的膜放于配制好的 UU 单克隆抗体 6522 中,4℃孵育过夜;
4) 用 TBST 清洗膜 5 次,每次 7min,转速保持 180~200r;
5) 取 1µL 辣根过氧化物酶标记的鼠二抗,加入到 5mL 的封闭液中,混匀;
6) 将膜放入配制好的二抗中,室温孵育 1h;
7) 用 TBST 清洗膜 5 次,每次 7min,转速保持 180~200r;
42
浙江大学博士学位论文 第二部分 材料与方法
8) 取出膜,加入显影液,用 ChemiDoc MP 化学发光凝胶成像系统进行成像
分析。
1.13 质谱检测
1) 蛋白提取和 SDS-PAGE 电泳同免疫印迹实验部分;
2) 将电泳完的目的条带进行切胶回收并保存在 10%冰醋酸中;
3) 委托杭州广科安德生物科技有限公司进行质谱检测。
1.14 药敏试验
1.14.1 菌株预培养
将冷冻于-80℃的 UPA106、UUR132、UUR315 菌液取出,置于冰上融化,待
完全融化后,以 1:9 的比例接种于 3mL 支原体液体培养基,37℃、5%CO2 条件
下预培养 2h。
1.14.2 药敏试验
1) 取一块 96 孔板,分别在 A2~H10 孔加入 180µL 的 UU 培养基;
2) 将事先配制好的各药物母液(浓度为 32mg/mL),用 UU 培养基稀释到终
浓度为 32µg/mL;
3) 取 2 块已加好培养基的 96 孔板,在板 1 的 C1、D1 孔加入 CIP,E1、F1
孔加入 LVX,G1、H1 孔加入 TET,板 2 的 A1、B1 孔加入 AZI,C1、D1
孔加入 ERY,E1、F1 孔加入 CHL,G1、H1 孔加入 GEN,每孔加入 360µL
浓度为 32µg/mL 的对应药物;
4) 分别从板 1 的 C1~H1 孔和板 2 的 A1~H1 孔吸 180µL 药液至第二列的
对应孔,吹打混匀后,再从第二列吸 180µL 培养基至第三列,依次倍比稀
释至第 9 列(药物终浓度为 0.125µg/mL)。第 10 列不加药,作为阴性对
照;
5) 板 1 的 A、B 两行用于 UU 的菌量计数,CCU(color change unit)。取出
43
浙江大学博士学位论文 第二部分 材料与方法
预培养的菌液,在板 1 的 A2 和 B2 孔中各加入 20µL 菌液,吹打混匀后,
再分别从 A2 吸 20µL 至 A3,从 B2 吸 20µL 至 B3,依次次倍比稀释至
A10 和 B10;
6) 在板 1 和板 2 加过培养基的剩余各孔中,分别加入 20µL 菌液,吹打混匀
后,盖上盖子,放置在 37℃、5%CO2 条件下培养;
7) CCU 结果判读:A 行或 B 行的最后一个变红孔 CCU 计数为 100,倒数第
二个变红孔 CCU 计数为 101,依次向前推,当 A2 或 B2 孔 CCU 计数为
104 时,进行药敏结果判读。
1.14.3 耐药机制分析
细菌的喹诺酮耐药通常与菌株 QRDR 区的基因突变相关,脲原体的 QRDR 区
包括gyrA基因的219bp~516bp,gyrB基因的1283bp~1551bp,parC基因的167bp~
436bp 以及 parE 基因的 1229bp~1503bp。分别选择敏感株 UPA ATCC 700970 和
UUR ATCC 33699 的 QRDR 区作为参考序列,研究 UPA 和 UUR 亚群喹诺酮耐药
菌株的基因突变情况。
UU的四环素耐药和携带tet(M)转座子有关,分析UPA106、UUR132和UUR315
的全基因组序列观察是否携带 tet(M)转座子。
UU 的大环内酯类耐药与菌株 L4、L22 和 23S rRNA 的基因突变相关,分别选
择敏感株 UPA ATCC 700970 和 UUR ATCC 33699 的 L4、L22 和 23S rRNA 基因
作为参考序列,研究 UPA 和 UUR 亚群大环内酯类耐药菌株的基因突变情况。
1.14.4 同源建模
基于肺炎链球菌ⅡA 型拓扑异构酶-DNA-LVX 复合物的蛋白结构(PDB ID:
3K9F),使用 Schrödinger Suite 2019-1 软件,构建野生型 UU 敏感株的拓扑异构
酶Ⅳ的三维结构。
1.14.5 分子对接和分子动力学模拟
依据鲍曼不动杆菌拓扑异构酶Ⅳ-DNA-莫西沙星复合物(PDB ID:2XKK)的
对接模式,进行 LVX-脲原体拓扑异构酶Ⅳ的分子对接,用共轭梯度法进行能量最
44
浙江大学博士学位论文 第二部分 材料与方法
小化,然后使用 Desmond 软件默认参数下进行系统能量平衡。再利用 Schrödinger
Suite 2019-1 软件的 Desmond 分子动力学模块对构建好的配体-蛋白复合物进行
50ns 的分子动力学模拟。
45
浙江大学博士学位论文 第二部分 结果
2 结果
2.1 二代全基因组测序 DNA 样本检测
使用试剂盒提取 UPA106、UUR132、UUR315 的全基因组,并对提取的基因
组进行质量检测。提取的基因组浓度从 16.9~137.8ng/µL 不等(表 2.1),电泳图
谱显示三株菌的基因组主带清晰,部分条带伴有轻度拖尾(图 2.1)。UUR315 的
基因组质量最高,被判定为 A 类样本,UPA106 和 UUR132 的基因组被判定为 B
类标本。自三株菌提取的基因组均符合二代 Illumina Hiseq 技术全基因组测序要求
(核酸总量≥50ng,起始浓度≥10ng/µL,起始体积≥5µL)。
表 2.1 菌株 UPA106、UUR132、UUR315 二代基因组测序样本检测结果
序号 菌株名称 浓度
(ng/µL) UV
260/280 UV
260/230 体积
(µL) 总量
(µg) 结果判定
1 UUR132 46.40 1.90 1.94 45.00 2.09 B 类
2 UUR132 21.70 1.81 0.73 45.00 0.98 B 类
3 UUR315 137.80 1.81 1.89 45.00 6.20 A 类
4 UPA106 22.80 1.87 1.52 10.00 0.23 B 类
5 UPA106 16.90 1.90 1.23 10.00 0.17 B 类
注:A 类表示条带单一,主带在 20,000bp 以上,满足所有基因组建库项目,荧光
定量 PCR。B 类表示条带单一,主带清晰但有轻度拖带,可用于基因组二代测序、
Mate 测序、扩增子测序,荧光定量 PCR。
46
浙江大学博士学位论文 第二部分 结果
图 2.1 菌株 UPA106、UUR132、UUR315 二代全基因组测序样本电泳图谱。1、2
号样本为 UUR132 的基因组,3 号样本为 UUR315 的基因组,4 号和 5 号样本为
UPA106 的基因组。M 表示 Marker (-Hind Ⅲ digest,23130bp)。
2.2 三代全基因组测序 DNA 样本检测
菌株 UPA106、UUR132、UUR315 的三代全基因组测序样本浓度为 101.9~
139.5ng/µL 不等,其中 UUR132 的基因组浓度最高(表 2.2)。电泳结果显示,三
株菌的基因组主带清晰并且伴有轻度降解(图 2.2)。三株菌提取的基因组均被判
定为 B-I 类的样本,该类样本可以用于三代 Nanopore 全基因组测序。
表 2.2 菌株 UPA106、UUR132、UUR315 三代全基因组测序样本检测结果
序号 菌株名称 浓度
(ng/µL) 体积
(µL) 总量
(µg) 样本完整性 结果判定
1 UPA106 101.9 20 2.0 B-I
主带清晰轻度
2 UUR132 177.1 20 3.5 B-I
降解,大小在
20Kbp 左右
3 UUR315 139.5 40 5.6 B-I
注:B-I 提示主带清晰无降解或轻度降解,大小在 20Kbp 以上或左右,无或伴轻度
RNA 或是蛋白污染。
47
浙江大学博士学位论文 第二部分 结果
图 2.2 菌株 UPA106、UUR132、UUR315 三代全基因组测序样本电泳图谱。1 号为
UPA106,2 号为 UUR132,3 号为 UUR315。M 表示 Marker (-Hind Ⅲ digest,
23130bp)。
2.3 基因组的基本信息
菌株 UPA106 的全基因组全长为 741,809bp,GC 含量是 25.5%,染色体为单
个闭合环状结构(图 2.3)。UPA106 共包含 627 个基因,6 个 rRNA 和 30 个 tRNA,
有 566 个基因能够编码成蛋白质。MLST 分析结果显示 UPA106 的序列型为 3,与
原始菌株分型一致。
菌株 UUR132 的全基因组全长为 825,366bp,GC 含量为 25.8%,染色体为单
个闭合环状结构(图 2.4)。在 UUR132 中共预测到 685 个基因,6 个 rRNA 和 30
个 tRNA,其中 628 个基因可编码为蛋白质。MLST 分析结果显示 UUR132 的序列
型为 212,与原始菌株分型一致。
菌株 UUR315 的全基因组全长为 853,955bp,GC 含量是 25.7%,染色体为单
个闭合环状结构(图 2.5)。在 UUR315 中共预测到 699 个基因,6 个 rRNA 和 30
48
浙江大学博士学位论文 第二部分 结果
个 tRNA,其中蛋白质编码基因数为 644 个。MLST 分析结果显示 UUR315 的序列
型为 90,与原始菌株分型一致(表 2.3)。
菌株 UPA106、UUR132 和 UUR315 的全基因组登录号分别为:CP041199、
CP041200、CP039963。
表 2.3 三株脲原体的基因组基本信息
菌株 种群 基因组大小
(bp) GC% 预测基
因数 蛋白编
码基因 rRNAs tRNAs 序列型
106 UPA 741,809 25.5 627 566 6 30 3
132 UUR 825,366 25.8 685 628 6 30 212
315 UUR 853,955 25.7 699 644 6 30 90
49
浙江大学博士学位论文 第二部分 结果
图 2.3 菌株 U. parvum 106 全基因组圈图。从外向内,第一、二两圈表示预测出的
CDS(方向为内反外正),第三圈表示 GC 含量(25.5%),第四圈表示 GC 偏移
信息,绿色表示偏移大于零,紫色表示偏移小于零。
50
浙江大学博士学位论文 第二部分 结果
图 2.4 菌株 U. urealyticum 132 全基因组圈图。从外向内,第一、二两圈表示预测
出的 CDS(方向为内反外正),第三圈表示 GC 含量(25.8%),第四圈表示 GC
偏移信息,绿色表示偏移大于零,紫色表示偏移小于零。
51
浙江大学博士学位论文 第二部分 结果
图 2.5 菌株 U. urealyticum 315 全基因组圈图。从外向内,第一、二两圈表示预测
出的 CDS(方向为内反外正),第三圈表示 GC 含量(25.7%),第四圈表示 GC
偏移信息,绿色表示偏移大于零,紫色表示偏移小于零。
2.4 共线性关系分析
Manve 软件将内部没有发生基因组重排的保守片段定义为局部共线块(locally
collinear block,LCB),在对 UPA106、UPA ATCC 27815、UUR132、UUR315 和
UUR ATCC 33699 的全基因组序列比对分析中,共识别出 5 个 LCB,除蓝色标记
LCB 在 UPA 和 UUR 种群中发生了基因重排,其余 4 个 LCB 在五株 UU 间保持着
52
浙江大学博士学位论文 第二部分 结果
良好的共线性关系,提示五株菌的基因组同源性高,蓝色标记 LCB 是 UPA 与 UUR
基因组差异的主要区域。图中序列高度代表对应位置基因的保守程度,由图 2.6 可
以看出 5 株 UU 菌株均包含至少一处非保守区域。
图 2.6 五株脲原体全基因组序列共线性分析
2.5 同源基因簇分析
菌株 UPA106、UPA ATCC 27815、UUR132、UUR315 和 UUR ATCC 33699 共
包含 3,185 个蛋白编码基因,在这些基因中,OrthoVenn 共识别出 652 个基因簇,
其中有 541 个基因簇在 5 株菌株中均存在,占全部基因簇的 82.98%,构成 UU 的
核心基因组。有 4 个基因簇仅存在于 UPA106 和 UPA ATCC 27815 中,是 UPA 的
独有基因簇。这 4 个基因簇共包含有 8 个基因,其中一个基因与末端脱氧核苷酸
转移酶基因高度相似,其余基因的功能未知。有 41 个基因簇仅存在于 UUR132、
UUR315 和 UUR ATCC 33699 中,构成 UUR 的独有基因簇。41 个基因簇共包含
126 个基因,其中 9 个基因参与编码 DNA 限制修饰系统,3 个基因编码 ATP 酶。
特有基因通常与个体的独特表型相关,在 UUR132 中发现一个特有的基因簇。此
外,与标准菌株相比,发现了 2 个仅存在于三株临床菌株的基因簇(图 2.7)。
53
浙江大学博士学位论文 第二部分 结果
单体基因(singleton)是指在其他菌株中不能找到直系同源的基因。本次分析
发现,UPA106 包含 40 个单体基因,UUR132 包含 15 个单体基因,UUR315 包含
22 个单体基因,UPA ATCC 27815 包含 21 个单体基因,UUR ATCC 33699 包含 14
个单体基因。
图 2.7 五株脲原体菌株的同源基因簇比较
2.6 基于 SNP 差异构建系统发育树
选择 UPA ATCC 27815 作为 UPA 亚群的参考菌株,全基因组长度为 751,679bp。
通过与参考基因组的比对分析,发现 UPA106 和 NCBI GenBank 数据库中已完成
全基因组测序的 14 株 UPA 的参考基因覆盖率接近 65%,共识别出 488,414 个 SNP
位点。UPA 的种间差异范围是 4~6,020 个 SNP,其中 ATCC 700970 和参考菌株
间的差异最小,1015a 和 445a 的差异最大。UPA106 和其他 UPA 菌株间 SNP 差异
是 496~5,645 个,UPA106 与菌株 ATCC 27818 间的 SNP 差异最小,与菌株 1051a
间的 SNP 差异最大(图 2.8)。
54
浙江大学博士学位论文 第二部分 结果
图 2.8 15 株 UPA 菌株间的 SNP 分析(UPA ATCC 27815 为参考菌株)
由于 UU 中存在大量的基因重组和水平转移现象,基于单个基因或多个基因
构建的系统发育树,因为数据量不足,容易造成结果与实际的偏差。全基因组序列
包含了菌株的全部遗传信息,基于全基因组构建的系统发育树,具有更高的分辨
率。连锁在 UPA 菌株中找到的 488,414 个 SNP 位点,多重比对后,构建进化树,
结果显示 UPA106 与标准菌株 ATCC 27818 亲缘关系最近,两株菌位于同一分支
(图 2.9)。
55
浙江大学博士学位论文 第二部分 结果
图 2.9 15 株 UPA 菌株基于全基因组 SNP 构建的系统发育树
选择 UUR ATCC 33699 作为 UUR 亚群的参考菌株,全基因组长度为 874,478bp。
比对分析发现,UUR132、UUR315 与 NCBI GenBank 数据库中剩余的 18 株 UUR
菌株的参考基因覆盖率为 50.39%,共找到 440,616 个 SNP 位点。UUR 的种间差异
范围是 33~5304 个 SNP,其中 ATCC 27618 和 ATCC 27818 的差异最小,1051 和
445 的差异最大。UUR132 和其他 UUR 菌株间 SNP 差异范围是 299~4987 个,
UUR132 与菌株 ATCC 27618 间的 SNP 差异最小,与菌株 445 间的 SNP 差异最
大。UUR315 和其他 UUR 菌株间的 SNP 差异范围是 646~4949 个,UUR315 与菌
株 1000 间的 SNP 差异最小,与菌株 445 间的 SNP 差异最大(图 2.10)。
56
浙江大学博士学位论文 第二部分 结果
图 2.10 20 株 UUR 菌株间的 SNP 差异(UUR ATCC 33699 为参考菌株)
连锁在 UUR 菌株中找到的 440,616 个 SNP 位点,多重比对后,构建进化树发
现,菌株 UUR132 和 UUR315 与数据库中现存 18 株 UUR 菌株亲缘关系较远。
UUR315 与两株分离自俄罗斯的菌株(1000 和 1000a)位于同一分支,相对亲缘关
系较近(图 2.11)。
57
浙江大学博士学位论文 第二部分 结果
图 2.11 20 株 UUR 菌株基于全基因组 SNP 构建的系统发育树
2.7 毒力基因分析
为了评估菌株 UPA106、UUR132、UUR315 的潜在致病作用,我们总结了存
在于三株菌株的毒力因子,并以标准菌株 UPA ATCC 27815 作为 UPA106 的参考
菌株,标准菌株 UUR ATCC 33699 作为 UUR132 和 UUR315 的参考菌株,进行了
毒力因子比较分析。在三株临床菌株中均未找到编码磷脂酶 C、A1 和 A2 以及 IgA
蛋白酶的基因。在三株临床菌株中共发现 14 个与毒力相关的蛋白,包括 O-唾液酸
糖蛋白酶,谷胱甘肽过氧化物酶,硫氧还蛋白氧化还原酶系统,丝氨酸/苏氨酸激
酶,溶血酶,脲酶家族蛋白。毒力因子在临床菌株和标准菌株中的序列比对结果显
示,UU 的大多数毒力因子相对保守,仅存在个别点突变的差异。与参考菌株相比,
在菌株 UPA106 和 UUR132 的 O-唾液酸糖蛋白酶编码基因均检测到一个点突变。
出现在 UPA106 的点突变为 A661G,该突变导致对应氨基酸序列第 122 位的 Ile 突
变为 Val,出现在 UUR132 的点突变为 G709A,该突变导致对应氨基酸序列第 237
位的 Ala 突变为 Thr。此外,在 UPA106 的硫氧还蛋白二硫化物还原酶编码基因中
58
浙江大学博士学位论文 第二部分 结果
观察到 A425G 点突变,该突变导致硫氧还蛋白二硫化物还原酶第 142 位的 Tyr 突
变为 Cys。在 UUR132 的丝氨酸/苏氨酸激酶的编码基因观察到 A148G 点突变,该
突变导致对应氨基酸序列第 50 位 Ser 突变为 Gly。在三株菌株的溶血酶编码基因
均检测到一个点突变,存在于 UPA106 的点突变是 A55G,该突变导致溶血酶的第
19 位的 Ile 突变为 Val。存在于 UUR132 与 UUR315 的点突变相同,均为 A981T,
该突变导致溶血酶的第 327 位的 Lys 突变为 Asn(表 2.4)。
59
浙江大学博士学位论文 第二部分 结果
表 2.4 菌株 UPA106、UUR132 和 UUR315 与标准菌株 UPA ATCC 27815、UUR ATCC 33699 的毒力基因比较分析
基因名称 a 编码蛋白 ATCC 27815 b ATCC 33699 b UPA106 c UUR315 c UUR132 c
N O-唾液酸糖蛋白酶 UPA3_0428 UUR10_0455 A661G (I221V) 100% G709A (A237T)
N 谷胱甘肽过氧化物酶 UPA3_0300 UUR10_0288 100% 100% 100%
N 硫氧还蛋白 UPA3_0629 UUR10_0694 100% 100% 100%
trxB 硫氧还蛋白二硫化物
还原酶 UPA3_0073 UUR10_0080 A425G (Y142C) 99% 99%
N 丝氨酸/苏氨酸激酶 UPA3_0223 UUR10_0210 100% 100% A148G (S50G)
N 溶血酶 UPA3_0071 UUR10_0078 A55G (I19V) A981T (K327N) A981T (K327N)
N 脲酶 UPA3_0446 UUR10_0472 100% 100% 100%
ureA 脲酶 γ 亚基 UPA3_0453 UUR10_0479 100% 100% 100%
ureB 脲酶 β 亚基 UPA3_0452 UUR10_0478 100% 99% 100%
ureC 脲酶 α 亚基 UPA3_0451 UUR10_0477 99% 100% 100%
ureD 脲酶辅助蛋白 UreD UPA3_0447 UUR10_0473 100% 100% 100%
ureE 脲酶辅助蛋白 UreE UPA3_0450 UUR10_0476 100% 100% 100%
ureF 脲酶辅助蛋白 UreF UPA3_0449 UUR10_0475 100% 100% 100%
ureG 脲酶辅助蛋白 UreG UPA3_0448 UUR10_0474 99% 100% 100%
注:a N 表示基因名称未知;b 标准菌株中的对应基因以 NCBI 注释的 locus_tag 表示;c 仅列出错义突变,括号内为基因突变
所导致的相应氨基酸序列的突变。
60
浙江大学博士学位论文 第二部分 结果
为了明确 MBA 家族基因在菌株 UPA106、UUR132、UUR315 中的变异机制,
依据系统进化树的分析结果,选择与三株临床菌株亲缘关系最近的标准菌株的
MBA 家族序列作为参考。UPA106 的参考菌株为 ATCC 27818 株,UUR132 的参
考菌株为 ATCC 27618,UUR315 的参考菌株为 ATCC 33696 株,分别对 3 组菌株
的 MBA 家族基因进行线性比较分析。
如图 2.12 所示,在菌株 UPA106 中发现 mba 基因座末端的整合酶缺失。菌株
ATCC 27818 mba 基因的 N 端与基因间区发生了 DNA 倒置,并且倒置后的基因与
相邻的 A0412 基因产生基因融合,形成了新的 mba 基因(UPA106 中的 01920 基
因)。序列分析发现,菌株 UPA106 的 MBA 蛋白 C 端不包含串联重复序列。此
外,在两株菌 mba 基因两侧的邻近基因,发现了 C 端串联重复数目的变异,如
01925 基 因 和 A0413 基 因 编 码 蛋 白 的 C 端 均 包 含 串 联 重 复 单 元
“VELVEQNAQLKKAKVKLTFSKAITLENEAQASLKLTLTKKGTQETKVVDLVL
NQDKTSATTKDLVEFTTDVYQI(V)SKLTLNDVEVNVDSVKNNDLKIAESTTTPK
EDKAVVSK”,在 01925 基因中该序列的重复数目为 4,而在 A0413 基因中序列的
重复数目为 2。UPA106 的 01915 基因编码蛋白和菌株 ATCC 27818 的 MBA 蛋白
(A0411 基因编码)包含相同的串联重复单元“EPGK”,基因 01915 的串联重复数
目为 20,MBA(A0411)的串联重复数目为 60(表 2.5)。
菌株 UUR132 与菌株 ATCC 27618 的 MBA 家族基因比对结果显示,存在于
ATCC 27618 的两个连续基因,mba(0422 基因)和 0423 基因,被一段长度为 1,062bp
的插入序列打断,并且该插入序列包含了基因 0418 的完整序列(长度 822bp)和
一 段 基 因 间 区 序 列 , 在 插 入 位 置 的 前 后 均 存 在 一 段
“AATTTTAATTATCAAACAGAA”的直接重复序列。菌株 ATCC 27618 mba 基因
的 N 端和一侧的基因间区发生了 DNA 倒置,倒置后的基因与插入的 0418 基因产
生基因融合,形成新的 mba 基因(UPA132 中的 02045 基因),并且在该基因的下
游不包含串联重复序列。UUR132 的 02055 基因编码蛋白与菌株 ATCC 27618 的
0423 基因编码蛋白的 C 端均包含串联重复单元“QNQEVVKL”,前者包含 16 个串
61
浙江大学博士学位论文 第二部分 结果
联重复单元,后者包含 29 个串联重复单元。此外,在 UUR132 的 02040 基因和
ATCC 27618 的 0420 基因之间也观察到了串联重复数目的变异,上述基因所编码
蛋 白 中 包 含 的 串 联 重 复 单 元 为
“NKDEKIQKAEEKLAKAKEELNKVNELVTTKDTAVKEATKALETAKADAKTK
EAAVTTATR(H)ELEEAKKSNEA”,02040 基因包含 5 个串联重复单元,0420 基
因包含 3 个串联重复单元。此外,在 UUR132 和 ATCC 27618 中发现了 6 个序列
高度相似的基因,其中 02025 基因和 02035 基因序列完全一致,0419 基因和 0425
基因序列完全一致,02060 基因和 0424 基因序列存在一个错义点突变。
与 UPA106 和 UUR132 不同,对 UUR315 和 ATCC 33696 的 MBA 家族基因
比对分析发现,DNA 倒置发生在 mba(A0418)的 C 端而非 N 端,UUR315 的
02080 基因包含了倒置后的 C 端序列。在菌株 UUR315 中,mba 的 N 端发生了突
变,导致翻译提前终止“MKLLKKKSFFFQNTKKQLFS*”。在 UUR315 的 02095 基
因和 ATCC 33696 的 A0422 基因也观察到了下游串联重复数目的变异,存在于上
述 基 因 编 码 蛋 白 的 重 复 单 元 为
“EDKAVVSSVELVDKDATTKKAKVKLTFSKALVVANETTPSLKLTLTKKGAQE
TKEVELVLSADKLSVTTKDLVEFATDTYNVSKLMINDVEANVDAIKSSDLKVA
EE”,02095 基因包含 1 个重复单元,A0422 基因包含 3 个重复单元。此外,与基
因 A0421 相比,在 UUR315 的 02090 基因中发现了两段包含相同串联重复序列
(QAMVQQAQKN)的插入片段,该插入突变在基因 02090 的编码蛋白中引入了
两个新的螺旋结构(图 2.13)。此外,在 UUR315 的 MBA locus 中还发现 2 个转
座元件(IS256)。
62
浙江大学博士学位论文 第二部分 结果
图 2.12 多带抗原家族基因在菌株 UPA106 与 UPA ATCC 27818,UUR132 与 UUR
ATCC 27618,UUR315 与 UUR ATCC 33696 的线形比较。文中提到的基因以 NCBI
注释的 locus_tag 后缀表示。
63
浙江大学博士学位论文 第二部分 结果
图 2.13 U. urealyticum 315 的 02090 基因与 U. urealyticum ATCC 33696(UUR12)
的 A0421 基因的比对分析。A. 两基因编码氨基酸序列的比对分析。两序列中的串
联重复单元“PGNGTTSPEK”用棕色标记,UUR315 中的插入序列用黄色标记,插
入序列中的串联重复单元“QAMVQQAQKN”用粗体表示。B. 两基因编码蛋白的螺
旋结构预测。在基因 02090 编码蛋白中预测到两个螺旋结构。
64
浙江大学博士学位论文 第二部分 结果
表 2.5 菌株 UPA106 与 UPA ATCC 27818,UUR132 与 UUR ATCC 27618,UUR315 与 UUR ATCC 33696 的 MBA 蛋白家族的
串联重复序列特征
菌株 基因 a 编码蛋白 N b N 端序列 c 串联重复单元 C 端序列
UPA106 01925 DUF1410 4
ATCC 27818 A0413 多带抗原 2 MNYQTVNFEQVPNQNSASTPATKEKSVVSN(V) VELVEQNAQLKKAKVKLTFSKAITL
ENEAQASLKLTLTKKGTQETKVVDL
VLNQDKTSATTKDLVEFTTDVYQI(V
)SKLTLNDVEVNVDSVKNNDLKIAES
TTTPKEDKAVVSK FTTDVYQVSK
LTLNDVEVN
VDSVKNNDL
KIA*
UPA106 01915 多带抗原 20 MNYQTEKVNFETAPKTQ(E)
MKLLKNKKFWAMTLGVTLVGAGIVAIAASCSNSTVKSKLSS
ATCC 27818 mba
(A0411) 多带抗原 60 QFVKSTDDKSFYAVYEIENFKDLSDNDKKSLNDIEFNAALTSV
ENKTENLVTKGHLVGEKIYVKLPREPKPNEQLTIINKSGLIKTS EPGK EPGAARK*
GLLIPNNLNYQTEKVNFETAPKTQ(E)
UUR132 02055 假定蛋白 16
ATCC 27618 0423 假定蛋白 29 MK(Q) QNQEVVKL QNQENKIYIF
FKKVPF*
MFILNFIIFCSYFYTKFYYFNYQTEKVDFGNTPTPSPTPTPTPTP NKDEKIQKAE
EPKKDEAVVSSVKFTKDEKKSNEAVVSLVFSKLELADSSKKA NKDEKIQKAEEKLAKAKEELNKVNE EKLAKAKEEL
UUR132 02040 DUF1410 5 FNLEVIKKGDTNPIKASDLKYDEASKTLTGKLTNLTKGEYSIS LVTTKDTAVKEATKALETAKADAK NKVNELVTT
KLTLNNNEINLNDTVKNSKLLIEDQNNNGNGGNEQGGQPSNP TKEAAVTTATR(H)ELEEAKKSNEA KDTAVKEAT
(N) KALETAKAD
65
浙江大学博士学位论文 第二部分 结果
菌株 基因 a 编码蛋白 N b N 端序列 c 串联重复单元 C 端序列
MDFGNAPTPSPTPTPTPTPEPTPTPKKDEVVISNVTFTKDEKKK AKTKEAAVT
ATCC 27618 0420 假定蛋白 3 DEATVSLVFSKLELADSSKKLFSLEITKKDDTNPIKASDLKYD
EASKTLTGKLTNLTKGEYSISKLTLNNNEINLNDTVKNSKLLI TATRELEEAK
K*
EDQNNNGNGGNEQGGQPSNP(N)
MNYQTEKVDFENTPTPSPTPTPKKDEAVVSSVTFTKVEKKSN
UUR315 02080 DUF1410 4 EATVSLVFSKLELADTSKKIFVLEVTKKDETTPIQVIDLKYDE
ASKTLTGKLTNLTKGEYSISKLTLNNNEINLNDTFKNSKLLIED
ATCC 33696 mba
(A0418) 多带抗原 4 QNNNGNGGNEQGNQPSN(P)
MKLLKNKKFWAITLGVTLVGAGVVAVAASCSSSNVKSKLSS
QLVKSKDEKSFYAVYDIENFDDLNENDKKALNEAEFNVAITS
AENKTENATTKGHLLNKKIYVKLPREPKAKEQLTIINKGGLL
KTASLVLPDNLNYQTEKVDFENTPTPSPTPTPKKDEAVVSSVT PKDQAEVDKLTKLIKEKEAKVAEVQ
KAIEEGEKVVKTKQATKTTAENELT
AAQKVVDDKKAEKTTLDKELADAK
AQLDKANKKD
PKDQDIGSNG
K*
FTKVEKKSNEATVSLVFSKLELADTSKKMFVLEVTKKDETTPI
QVIDLKYDEASKTLTGKLTNLTKGEYSISKLTLNNNEINLNDT
FKNSKLLIEDQNNNGNGGNEQGNQPSN(P)
UUR315 02095 假定蛋白 1 EDKAVVSSVELVDKDATTKKAKVK
LTFSKALVVANETTPSLKLTLTKKGA
ATCC 33696 A0422 多带抗原 3 MNYQTEKVEFENTPTPTPKPTPTPTPK(E) QETKEVELVLSADKLSVTTKDLVEF
ATDTYNVSKLMINDVEANVDAIKSS QVNPAT*
DLKVAEE
66
浙江大学博士学位论文 第二部分 结果
菌株 基因 a 编码蛋白 N b N 端序列 c 串联重复单元 C 端序列
UUR315 02090 假定蛋白 10 &
8 MNYQTEKVEFETQ(P) PGNGTTSPEK & QAMVQQAQKN QQNKIYIFF*
ATCC 33696 A0421 多带抗原 19 PGNGTTSPEK PAK*
注:a 基因以 NCBI 注释的 locus_tag 后缀表示,b N 表示串联重复单元个数,c 括号内的氨基酸表示该序列中串联重复序列的第一
个氨基酸。
67
浙江大学博士学位论文 第二部分 结果
使用单克隆抗体 6522 检测三株菌中 MBA 蛋白表达情况,在 UPA106 中共检
测到 3 个蛋白条带,条带分子量大小在 27~49KDa 之间,其中分子量最大的蛋白
条带与 UPA106 中预测的 mba 基因的蛋白分子量一致(48.15KDa)。在 菌株 UUR132
中共检测到 3 个蛋白条带,条带分子量大小在 36~56KDa 之间,其中分子量最大
的蛋白条带与 UUR132 中预测的 mba 基因的蛋白分子量相近(52.67KDa)。在菌
株 UUR315 中共检测到 6 个蛋白条带,条带分子量大小在 36~90KDa 之间,未能
在 UUR315 的全基因序列中未找到与这些蛋白条带所对应的基因(图 2.14)。
图 2.14 菌株 UPA106, UUR132 和 UUR315 的 MBA 蛋白检测结果
为明确上述条带所对应的蛋白,对菌株 UPA106,UUR132 和 UUR315 中识别
出的 12 个蛋白条带分别进行质谱检测,送检条带标记如图 2.15。UPA106 的 1 号
条带(分子量约为 49KDa)共检测出 210 个蛋白,依据 PSM,Unique peptides 以
及蛋白分子量,筛选出一个最可疑的 MBA 蛋白,该蛋白编码基因为 FJM04_01920。
结合之前分析,该蛋白可能为 UPA106 的 01920 基因编码的 MBA 蛋白,将 UPA106
68
浙江大学博士学位论文 第二部分 结果
的 MBA 基因序列与筛选到的 MBA 蛋白序列进行比对,发现两个蛋白的氨基酸序
列完全一致(100%),进一步确定 1 号条带为 MBA 蛋白。UPA106 的 2 号条带
(分子量约为 36KDa)共检出 225 个蛋白,结合质谱检测参数筛选出 3 个可疑蛋
白。UPA106 的 3 号条带(蛋白分子量约为 27KDa)共检出 328 个蛋白,筛选出 3
个可疑蛋白。在这两个条带筛选出的蛋白中,均包含由 FJM04_01920 基因编码的
MBA 蛋白。
UUR132 的 4 号条带对应蛋白分子量约为 56KDa,共检测出 263 个蛋白,经
过分析比对,筛选出一个可疑蛋白。在之前分析中,4 号条带与 UUR132 中 02045
基因编码的 MBA 蛋白的预测分子量相近。将筛选到的可疑蛋白序列与 UUR132 中
MBA 蛋白进行比对,发现 4SV 基因编码的 MBA 片段(长度为 277 个氨基酸)与
02045 基因编码的 MBA(长度为 475 个氨基酸)蛋白的前 262 个氨基酸序列的相
似度为95%,确定4号条带为MBA蛋白。UUR132的5号条带,分子量约为46KDa,
共检测到 250 个蛋白。根据质谱结果共筛选到 4 个可疑蛋白。UUR132 的 6 号条
带,分子量约为 37KDa,共检测到 217 个蛋白,经分析筛选出 1 个可疑蛋白。在
UUR132 的第 5、6 号条带中均发现一个 4SV 基因编码的 MBA 蛋白片段。
UUR315 的第 7 号条带,分子量约为 90KDa,质谱共检测到 24 个蛋白,经过
分析筛选出一个可疑蛋白。该蛋白是由基因 UUR9_0295 编码的脂蛋白,序列比对
分析发现,基因 UUR9_0295 在 UUR315 的对应基因为 EPH05_00215(位于
49,420~51,939bp),编码产物为假定蛋白,预测的蛋白分子量是 95.92KDa。假定
蛋白的 N 端起始序列为“MKKLKLITLSLPIPIVAIM”,整个序列不包含串联重复单
元。第 8 号条带,分子量约为 80KDa,质谱共检测到 37 个蛋白。在 37 个蛋白中,
筛选到一个可疑蛋白,由基因 UUR9_0286 编码的非典型蛋白。UUR315 的
EPH05_00260 基因(位于 65,285~67,447bp)与基因 UUR9_028 序列相同,该基因
编码产物为假定蛋白,预测的蛋白分子量为 83.74KDa。第 9 号条带,蛋白分子量
为 67KDa,共检测到 31 个蛋白。经分析筛选出一个可疑蛋白,由 UUR10_0162 编
码 的 MBA。UUR315 的 EPH05_00805 基因( 位于 191,706~193,460bp )与
69
浙江大学博士学位论文 第二部分 结果
UUR10_0162 基因仅存有一个核苷酸的差异,该基因的编码产物为 DUF1410 结构
域包含蛋白,蛋白分子量预测为 65.64KDa。DUF1410 结构域包含蛋白的 N 端起始
序列为“MKLLKNKKFWAMSLGAIAISTSIVAF”。第 10 号条带,对应蛋白分子量
为 53KDa,质谱共检测到 65 个条带。经分析筛从中选到一个可疑蛋白,由
EPH05_02080 基因(位于 460,832~462,313bp)编码的 DUF1410 结构域包含蛋白,
EPH05_02080 基因是存在于 UUR315 中的基因,基因序列中包含 4 个串联重复单
元,翻译后蛋白的分子量为 54.3KDa。第 11 条的蛋白分子量为 47KDa,质谱共检
测到 79 个蛋白,经分析从中选出了一个可疑蛋白,是由 UUR10_0416 基因编码的
假定的脂蛋白。UUR315 的 EPH05_03245 基因(位于 770,281~771,477bp)与
UUR10_0416 基因序列一致,编码产物为假定蛋白,预测蛋白分子量为 46.6KDa
(表 2.6)。12 号条带,蛋白分子量为 36KDa,质谱共检测到 30 个蛋白,未能在
这些蛋白中找到可疑蛋白。
图 2.15 菌株 UPA106, UUR132 和 UUR315 的蛋白电泳条带质谱检测标记
70
浙江大学博士学位论文 第二部分 结果
表 2.6 菌株 UPA106,UUR132 和 UUR315 的蛋白电泳条带质谱检测结果
条带
序号 a UniProtKB 数据
库编号 编码蛋白 基因 序列覆盖度
(%) 多肽 PSMs 特异性
多肽 分子量
(kDa)
1 A0A514JC09 多带抗原 FJM04_01920 58 27 52 19 48
2 B1AJG3 延伸因子 Tu tuf 71 32 78 19 35
2 A0A514JC09 多带抗原 FJM04_01920 71 24 48 22 43
2 A0A514JAA5 核糖体蛋白 L22 rplV 75 26 44 26 39
3 B1AJI1 核糖体蛋白 L1 rplA 76 17 38 7 25
3 A0A514JC09 多带抗原 FJM04_01920 45 18 33 18 48
3 A0A368MDT5 核苷酸交换因子 GrpE grpE 50 12 31 4 26
4 Q9RH88 多带抗原(片段) 4 SV 55 18 259 4 30
5 B1AJG3 延伸因子 Tu tuf 82 35 177 18 43
5 Q9RH88 多带抗原(片段) 4 SV 47 12 129 7 30
5 B3XSX0 组氨酸-tRNA 连接酶 hisS 66 26 30 26 49
5 B3XTX6 假定脂蛋白 UUR9_0396 47 19 27 19 47
6 Q9RH88 多带抗原(片段) 4 SV 42 10 120 5 30
7 B3XS56 脂蛋白 UUR9_0295 8 7 8 7 95
8 B3XS47 非典型蛋白 UUR9_0286 31 19 21 19 84
9 B5ZAX7 多带抗原 UUR10_0162 19 8 8 8 66
10 A0A514J900 DUF1410 结构域包含蛋白 EPH05_02080 16 3 5 3 54
11 B5ZC74 假定脂蛋白 UUR10_0660 9 4 4 4 47
注:a 序号与图 2.15 的蛋白条带对应,第 12 号条带未筛选出可疑蛋白。
71
浙江大学博士学位论文 第二部分 结果
2.8 药敏结果
UPA106、UUR132 和 UUR315 的药敏结果如表 2.7 所示。三株 UU 菌株对七
种 抗 生 素 表 现 出 不 同 的 敏 感 性 , CIP 的 MIC 值 在 三 株 菌 株 中 均 最 高
(16~>64µg/mL),其次为 GEN(8~64µg/mL),TET 的 MIC 值在三株菌株中
最低(0.25~1µg/mL)。CLSI 包含 UU 对 LVX、TET 和 ERY 的药敏折点,当
MIC≥4µg/mL 定 义 为 LVX 耐 药 ; 当 MIC≥2µg/mL 定 义 为 TET 耐 药 ; 当
MIC≥16µg/mL 定义为 ERY 耐药。依据 CLSI 推荐的药敏折点判断,UPA106 和
UUR132 是 LVX 耐药,三株菌均为 TET 敏感株,UUR132 表现为 ERY 耐药。
与敏感株 UPA ATCC 700970 或 UUR ATCC 33699 的 QRDR 区序列比较分析
发现,喹诺酮耐药株 UPA106 和 UUR132 的 gyrA 和 gyrB 基因未发生存在突变,
在菌株 UPA106 的 parE 基因发现一个点突变 G1343A,该突变导致 parE 亚基 448
位的 R 突变为 K,在菌株 UUR132 的 parC 基因发现点突变 C248T,该突变导致
parC 亚基 83 位的 S 突变为 L。与 TET 的药敏结果一致,在三株菌株中均未检测
到 tet(M)转座子。与敏感株 UUR ATCC 33699 的 L4、L22 和 23S rRNA 的基因序列
相比,仅在大环内酯类耐药株 UUR132 的 L4 基因发现一个同义点突变 C141T
(G47G),L22 和 23S rRNA 基因均未观察到突变(表 2.7)。
72
浙江大学博士学位论文 第二部分 结果
表 2.7 菌株 UPA106、UUR132 和 UUR315 的药敏结果和耐药突变位点
喹诺酮类 四环素类 b 大环内酯类 氯霉素类 氨基糖苷类
LVX a
(µg/mL) CIP a
(µg/mL) gyrA gyrB parC parE TET a
(µg/mL) tet(M) b ERY a
(µg/mL) AZI a
(µg/mL) L4 L22 23S
rRNA CHL a
(µg/mL) GEN a
(µg/mL)
UPA106 4 16 G1343A=
R448K 0.25 N 8 4 2 8
UUR132 4 >64 C248T=
S83L 1 N 16 8 8 64
UUR315 1 16 0.25 N 8 4 2 16
注:a LVX 表示左氧氟沙星(Levofloxacin);CIP 表示环丙沙星(Ciprofloxacin);TET 表示四环素(Tetracycline);ERY 表示
红霉素(Erythromycin);AZI 表示阿奇霉素(Azithromycin);CHL 表示氯霉素(Chloromycetin);GEN 表示庆大霉素(Gentamicin)。
b N 表示不存在 tet(M)转座子。
73
浙江大学博士学位论文 第二部分 结果
通过构建UU拓扑异构酶Ⅳ-LVX复合体的三维结构发现,parC 亚基的Ser83、
Glu87,parE 亚基的 Asp427、Arg448 和 Glu467 是构成对接口袋的重要亚基。parC
亚基 Ser83 的羟基残基直接借助氢键与 LVX 的 C-3 位的羧酸相互作用。parC 亚基
的 Glu87 的羧基侧链通过水-镁离子桥,间接与 LVX 的 C3/C4 酮酸相互作用。ParE
亚基的 Glu467 的羧基侧链借助离子键与 LVX 的 R 残基直接相互作用。ParE 亚基
的 Asp427、Arg448 与 LVX 之间不存在相互作用力,但是 Asp427 借助氢键和部分
离子键将 Arg448 的巨大侧链牢牢固定,避免了 Arg448 侧链对 LVX 与 parE 亚基
结合产生的位阻效应。这些氨基酸的共同作用稳定了 LVX 与 UU 拓扑异构酶Ⅳ的
结合(图 2.16)。
图 2.16 脲原体拓扑异构酶Ⅳ(ParC-ParE 亚基)与左氧氟沙星结合模式图。图中黄色
虚线表示氢键,紫色虚线表示离子键,紫色的球表示镁离子,周围环绕 4 个水分
子。
74
浙江大学博士学位论文 第二部分 结果
UUR132 的喹诺酮类耐药与 ParC 亚基 Ser83 突变为 Leu 有关,突变后的 Leu
与 LVX 之间不能形成氢键,同时 Leu 的巨大侧链占据了 LVX 第 3 位碳原子上羧
酸的结合部位。UPA106 的喹诺酮类耐药与 ParE 亚基 Arg448 突变为 Lys 有关,突
变后的 Lys 与 ParE 亚基 Asp427 不能再通过氢键形成稳定的相互结合,Lys 的巨大
侧链会对 LVX 产生撞击。这两个位点的突变都是通过减弱喹诺酮类药物与靶蛋白
的结合,从而导致 UU 耐药。
75
浙江大学博士学位论文 第二部分 讨论
3 讨论
支原体是基因组最小的,能够自主复制的微生物 [63]。UU 属柔膜纲支原体目
支原体科,其基因组大小在 751,679~874,478bp,并且 UUR 亚群菌株的全基因长度
大 于 UPA 亚 群 菌 株 [17] 。 本 次 研 究 的 三 株 临 床 分 离 UU 的 基 因 组 在
741,809~853,955bp,其中 UUR315 的基因组最大,UPA106 的基因组最小。低 GC
含量是柔膜纲微生物的一个普遍特征。本次研究中的三株菌株的 GC 含量均偏低,
大约为 25%。与两株标准菌株 ATCC 27815 和 ATCC 33699 的全基因组比较基因
组学分析显示,UU 的全基因序列高度保守。这可能与 UU 在进化过程中,丢失了
大量的非必需基因,仅保留与维持生长发育相关的基因有关。
有报道指出在 UU 中存在大量的基因水平转移现象 [17,64],因此,基于单个基
因构建的系统发育树,并不适于研究 UU 的种群结构。全基因组序列包含了菌株的
全部遗传信息,利用全基因组的数据来构建系统发育树,能够克服单个基因,由于
数据量不足而带来的偏差 [65]。本研究基于全基因组 SNP 的差异构建的进化树,有
助于准确地理解三株临床 UU 菌株与 NCBI GenBank 数据库中全部已完成全基因
组测序 UU 菌株的亲缘关系。UPA106 与标准菌株 ATCC 27818 的亲缘关系最近,
仅存在 496 个 SNP 差异。与 UPA106 相比,UUR132 和 UUR315 与数据库中其他
已测序的 UUR 菌株的亲缘关系相对较远。在这些已完成测序的 UUR 菌株中,有
8 株是分离自俄罗斯和美国的临床菌株。结果提示,自不同地区分离 UU 菌株的基
因组间存在很大差异,彼此间的亲缘关系较远。
携带毒力因子是许多致病性微生物的重要病原学特征 [66,67],本次研究中共分
析了 15 个存在于 UU 的潜在毒力因子。Paralanov 等人报道 O-唾液酸糖蛋白酶可
能与 UU 逃避宿主免疫有关,谷胱甘肽过氧化物酶和硫氧还蛋白氧化还原酶系统
可能与 UU 抵抗氧化应激有关 [17]。在生殖支原体中,丝氨酸/苏氨酸激酶的突变会
导致菌株毒力的减弱 [68]。UU 的溶血酶兼具溶血素活性和细胞毒性 [33]。脲酶是
UU 能量代谢的关键酶,能够分解尿素产生氨,但是由于 UU 缺乏将氨转化为谷氨
76
浙江大学博士学位论文 第二部分 讨论
酰胺或谷氨酸的酶,脲酶代谢会造成局部氨的大量积累,从而对组织造成损伤。比
较基因组学分析结果显示,上述毒力因子的编码基因在 UU 中存在保守,特别是与
能量代谢相关的脲酶基因。
MBA 是存在于 UU 表面的脂蛋白,被认为是 UU 的主要毒力因子。MBA 能
够被宿主细胞的 Toll 样受体识别,诱导产生细胞因子 [29]。在 MBA 的 N 端有一个
保守结构域,而 C 端是一个高度可变的结构域。除菌株 UUR13 外,其余 13 种血
清型菌株的 C 端均包含有数目不等的串联重复序列。UPA106 和 UUR132 的 MBA
蛋白与 UUR13 类似,C 端结构域不包含串联重复序列。存在于 UUR 菌株 N 端的
保守起始序列为“atgaaattattaaaaaaagaaattttgagcaattacactaggtaact”,序列在 UUR315 突
变为“atgaaattattaaaaaaaaaaagttttttttttttcaaaacactaaaacactttagttaa”,对应的氨基酸序列在
第 21 位是一个终止密码子“MKLLKKKSFFFQNTKKQLFS*”,导致在菌株 UUR315
中,MBA 保守 N 端序列的缺失。
研究人员在 UU 慢性感染宿主体内,检测到了 MBA 蛋白分子量的变异。当使
用针对 MBA 的单克隆抗体进行蛋白免疫印迹试验时,同一株 UU 菌株会同时检测
到多个蛋白条带。研究人员分别用针对 MBA 保守 N 端的引物和针对 MBA 下游的
引物对菌株的进行 PCR 试验发现,使用下游引物的 PCR 反应会扩增出多个核酸条
带,并且核酸条带的大小和检测到的蛋白的分子量相一致 [69,70]。研究人员因此提
出,MBA 分子量的变异与 C 端串联重复数目的多少有关。Blanchard 等人使用单
克隆抗体 6522 检测 14 株 UU 标准菌株的 MBA 表达情况,在菌株 ATCC 27818 识
别出一条分子量为 70KDa 的蛋白条带,在菌株 ATCC 27618 中识别出一条分子量
为 90KDa 的蛋白条带,在菌株 ATCC 33696 中识别出一条分子量为 75KDa 的蛋白
条带 [71]。以上三株菌株分别是与 UPA106、UUR132 和 UUR315 亲缘关系最近的
标准菌株。在本研究中使用相同的单克隆抗体检测三株临床菌株中 MBA 的表达情
况,在三株菌中均发现多个蛋白条带,表明三株临床菌株存在 MBA 分子量的变异。
对所有蛋白条带进行质谱检测发现,UPA106 中分子量最大条带对应 01920 基
因编码的 MBA 蛋白,UUR132 中分子量最大条带对应 02045 基因编码的 MBA 蛋
77
浙江大学博士学位论文 第二部分 讨论
白。在两菌株分别剩余两条带对应的可疑蛋白中也发现了 01920 基因编码的 MBA
和 02045 基因编码的 MBA。由于 MBA 的 C 端包含有大量串联重复序列,有学者
猜测不同分子量 MBA 蛋白与滑移突变有关 [72]。但是菌株 UPA106 和 UUR132 的
MBA 编码基因的下游均不包含串联重复序列,两株菌 MBA 分子量变异的机制还
有待进一步研究。Paralanov 等人发现与编码 MBA 蛋白相关的基因集中分布在 mba
基因座,mba 基因座的一端邻近 DNA pol Ⅲ的 α 亚基,另一端是 Xer-C 位点特异
性的重组酶,并且每个 MBA 基因座内均包含一个保守的 N 端序列 [17]。对 UUR315
的 6 个电泳条带质谱检测发现,有 5 个条带可以找到对应的可疑蛋白,这些蛋白
多为 MBA 蛋白片段、膜脂蛋白等。编码上述蛋白的基因分布在 UUR315 的整个基
因组(49,420~771,477bp),其中某些基因能够编码与 MBA 蛋白类似的 N 端序
列,有一个基因下游包含 4 个串联重复单元。因此,我们推测 UU 中存在大量的
mba 基因,这些基因呈散在分布。菌株 UUR315 的 mba 基因座内虽不存在 N 端保
守序列,但是也检出了 MBA 蛋白条带,提示 N 端保守序列可能并不是构成 MBA
所必需的。此外,对 mba 基因座的比较分析发现,串联重复数目的变异并不局限
于发生在 mba 基因下游,mba 基因座内任何下游包含串联重复序列的基因都有可
能发生该突变。
Zimmerman 等人报道了 MBA 变异的另一种分子机制,即发生在 mba 的 N 端
编码基因与其周围基因的基因倒置现象。研究人员发现,用针对 MBA 和针对 MBA
邻近蛋白的抗体刺激 UU,UU 会出现基因倒置现象,从而关闭靶蛋白的表达 [73]。
研究人员在包含有 MBA 蛋白 N 端相似序列的 UU172 和邻近的 UU171,也观察相
同的基因倒置现象 [74]。然而,菌株 UUR315 的基因倒置发生在 mba 的 C 端可变
区。上述两种变异机制均被认为与 UU 的宿主免疫逃避相关。在菌株 UUR315 的
02090 基因还发现一段串联重复序列的插入,该插入导致了蛋白结构的变化。在
UUR315 的 MBA 家族基因中还发现两个移动元件。这些结果提示插入突变也是
MBA 的变异机制。
78
浙江大学博士学位论文 第二部分 讨论
喹诺酮类、四环素类和大环内酯类是治疗 UU 感染有效的抗生素 [75]。获得性
喹诺酮类耐药与发生于 QRDR 区(gyrA、gyrB、parC 和 parE 基因)的基因突变有
关 [76,77]。UU 中最常见的与喹诺酮耐药相关的突变是发生于 parC 基因的 S83L 突
变 [40,55,78],在喹诺酮耐药株 UUR132 中发现此突变。在菌株 106 中检测到发生于
parE 基因的 R448K,该突变也被证明与 UU 的喹诺酮耐药有关 [36]。蛋白三维结
构显示,这两个位点的突变均是通过减弱药物与靶蛋白的结合力,从而导致 UU 耐
药。UU 的大环内酯类耐药与发生于 23S 核糖体 RNA 和核糖体蛋白 L4、L22 的突
变有关 [41]。但在本次研究中,大环内酯类耐药株 UUR132 的上述基因中仅观察到
一个无义突变,耐药机制有待进一步研究。
79
浙江大学博士学位论文 第二部分 结论
4 小结
本部分研究完成了首株我国临床分离 UUR 菌株的全基因组测序。通过比较基
因组学分析发现,UU 的全基因组序列高度保守,UPA 与 UUR 在基因水平上存有
差异。除 MBA 家族基因外,UU 的毒力因子都很保守,尤其是脲酶家族基因。MBA
家族基因在 UU 菌株间的差异很大,并且 MBA 的突变机制复杂多样。MBA 的保
守 N 端可以发生突变,造成该片段的缺失;MBA 的 N 端和 C 端均可以发生 DNA
倒置突变;mba 基因座内任何下游包含串联重复序列的基因均可以发生 C 端串联
重复数目的突变。插入突变也是 MBA 的突变机制。
80
浙江大学博士学位论文 结论和展望
结论和展望
结论
本研究中,我们使用多位点分型方法分析了 96 株分离自女性不孕患者和 102
株分离自男性不育患者 UU 的克隆分布情况。女性不孕患者分离的 85 株 UPA 中
发现 24 个 eST 型,其中 eST16 和 eST41 是优势克隆株;分离的 11 株 UUR 中发
现 10 个 eST 型,其中 eST82 是优势克隆株。男性不育患者分离的 78 株 UPA 中检
出 32 个 eST 型,其中 eST16 和 eST41 为优势克隆株;分离的 24 株 UUR 中检出
16 个 eST 型,其中 eST82 是优势克隆株。基于多位点分型方案中的基因构建系统
发育树,依据菌株亲缘关系,进一步将 UPA 分为 5 个亚组(亚组 A~E),UUR
分为 2 个亚组(1~2)。比较分析 UU 的两个种群和 7 个亚组在女性不孕患者和男
性不育患者的分布情况发现,无论是在女性不孕患者还是男性不育患者中,UPA 的
检出率均高于 UUR。与男性不育患者比,UUR 在女性不孕患者的检出率偏低
(P<0.05),并且未检测到 UUR 的亚组 2。结合精液参数,通过与 UU 阴性组男
性不育患者比较,研究 UU 不同亚组菌株对精子质量的影响发现,与阴性组比,精
子浓度、总活力和前向运动力在 UU 阳性各亚组呈现不同的变化,但是差异均没有
统计学意义(P>0.05)。UUR 亚组 2 的精子总活力均值和前向运动力均值,仅接
近参考值下限的一半。由于 UUR 亚组 2 中仅包含 2 例患者,数据量不足,该亚组
对精子活动能力的影响还有待研究。
我们在上述菌株中选了三株分别属于亚组 A、亚组 1 和亚组 2 的菌株,即
UPA106、UUR132 和 UUR315,并对三株菌分别进行了二代 Illumina 和三代
Nanopore 高通量测序。结合标准菌株 UPA ATCC 27815 和 UUR ATCC 33699,对
三株菌进行了比较基因组学分析,包括全基因组共线性关系分析、直系同源基因簇
分析以及毒力因子变异情况分析。发现 UU 不同菌株间存在良好的共线性关系,高
达 82.98%的基因簇在 UU 菌株间共享,构成 UU 的核心基因。分析存在于三株菌
81
浙江大学博士学位论文 结论和展望
的毒力因子发现,仅少数基因检测到单个点突变,三株菌的脲酶家族基因均未发现
错义突变。在 NCBI GenBank 数据库的全部已测序 UPA(共 15 株)和 UUR(共
20 株)中,分别选择与 UPA106、UUR132 和 UUR315 亲缘关系最近的标准菌株作
为参考,分析 MBA 家族基因的变异情况。发现 UPA106 和 UUR132 的 mba 基因
的 N 端与基因间区均发生了 DNA 倒置突变。倒置后的基因与相邻的 A0412 基因
产生基因融合,形成 UPA106 的 mba 基因;倒置后的基因与插入的 0418 基因产生
基因融合,形成 UUR132 的 mba 基因。两菌株 mba 基因的下游均不不包含串联重
复序列。在 UUR315 中,mba 的 N 端发生了突变,造成翻译提前终止;在 mba
(A0418)的 C 端发生了 DNA 倒置,倒置后形成了 02080 基因;在 02090 基因中
发现了两段包含相同串联重复序列的插入片段,该插入引入了两个新的螺旋结构。
此外,在三株菌 mba 基因两侧的基因均观察到 C 端串联重复数目的变异。
综合上述研究结果得出论文的主要结论如下:
(1)UU 在女性不孕患者和男性不育患者中呈现以优势克隆为主的多克隆分
布,优势克隆是 eST16、eST41 和 eST82。
(2)除 MBA 家族基因外,UU 的毒力因子都很保守,尤其是脲酶家族基因。
(3)MBA 家族基因的突变机制复杂多样。MBA 的保守 N 端可以发生突变,
造成该片段的缺失;MBA 的 N 端和 C 端均可以发生 DNA 倒置突变;mba 基因座
内任何下游包含串联重复序列的基因均可以发生 C 端串联重复数目的突变。插入
突变也是 MBA 的突变机制。
展望
1. 本研究使用多位点分型方案研究了 UU 在女性不孕患者和男性不育患者的
流行分布,并结合精液参数分析了 UU 不同亚组对精子质量的影响。发现精子总活
力和前向运动力在 UUR 亚组 2 均低于参考下线,并且与阴性组相比,非前向运动
力在 UUR 亚组 2 出现减低(P<0.05)。但是由于本次研究纳入的患者数目有限,
UUR 亚组 2 仅包含 2 例男性不育患者,分析结果的可靠性不足。UUR 亚组 2 对精
82
浙江大学博士学位论文 结论和展望
子运动力的影响还需要进一步研究。此外,在分析 UU 对精液质量影响过程中,本
研究未考虑患者是否有生殖道感染症状以及精液中的白细胞数量。希望在后续研
究中,能够纳入更多的患者,并且将精液白细胞数量以及是否有生殖道感染症状纳
入分析范围。
2. 本研究应用比较基因组学方法研究了 UU 的主要毒力因子 MBA 的变异机
制,但是由于 NCBI Genbank 数据库中 UU 菌株数量非常有限,可能会导致选择的
参考菌株与所研究菌株间的亲缘关系相对较远,对分析结果产生一定影响。希望能
够借助高通量测序的迅猛发展之力,完成更多 UU 的全基因测序,对准确和全面地
认识 UU 奠定基础。
3. 本研究通过对标准菌株和临床菌株中毒力因子的比较分析,发现存在于 UU
的大多数毒力因子都很保守,仅 MBA 家族基因表现出很大的差异,并且 MBA 家
族基因变异的机制复杂多样。研究人员在对 14 株 UU 标准菌株和 4 株临床菌株的
基因组序列分析中发现,UU 中包含大量与 MBA 表达相关的基因,在一些基因中
还发现了串联重复片段。这些串联重复序列被认为和 MBA 表达状态的改变有关。
研究人员指出,不同的串联重复序列的免疫原性可能存在差异,从而造成 UU 致病
性的改变。结合本研究毒力因子比较分析的结果,我们推测 UU 不同菌株间致病性
的差异很可能是由 MBA 突变引起。在菌株 UUR315 的 MBA 家族基因中发现两段
包含相同串联重复序列的插入,该插入引入了两个螺旋结构,造成蛋白结构的改
变。蛋白的构想决定了其功能。因为 MBA 蛋白的独特性和对 MBA 蛋白结构研究
的缺乏,没有办法基于已经解析蛋白结构对 MBA 进行结构预测。然而明确 MBA
蛋白的结构对于明确该蛋白的功能和作用机制有很大帮助,基于此,我们希望借助
冷冻电镜技术,解析出 MBA 蛋白的结构,结合蛋白结构研究 MBA 在 UU 感染中
的作用以及 MBA 变异对 UU 毒力的影响。
83
浙江大学博士学位论文 参考文献
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文献综述
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杨婷 综述 谢鑫友 校审
脲原体(Ureaplasma spp.,UU)属柔膜纲支原体目支原体科脲原体属,是人
类泌尿生殖道常见的共生型微生物,常寄居于人体泌尿生殖道粘膜表面,大约有
40~80%性成熟女性的宫颈或阴道粘膜 UU 检测阳性,在 16~44 岁健康男性中 UU
的检出率为 5~15%。UU 可引起多种与泌尿生殖道相关的感染性疾病,如非淋球
菌性尿道炎、不孕不育、绒毛膜羊膜炎等。如果在妊娠期感染 UU,可导致早产、
流产、新生儿支气管肺发育不良、坏死性小肠结肠炎和中枢神经系统损伤等。免疫
力低下人群感染 UU 时,会引起高氨血症。UU 的致病机制与其携带的毒力因子密
切相关,多带抗原是 UU 表面蛋白的主要组成成分,也被认为是 UU 的主要毒力因
子。本文将对与 UU 感染相关的临床疾病以及 UU 的致病机制进行简要综述。
1 UU 的生物学特性
脲原体(Ureaplasma spp.,UU)属柔膜体纲支原体目支原体科,于 1954 年首
次从男性非淋球菌性尿道炎患者的尿道分泌物中发现并分离 [1]。由于 UU 在固体
培养基中形成的菌落微小(5~20µm),且菌落形态与人型支原体相似,UU 最初
被命名为微小型胸膜肺炎样生物(Tiny-form pleuropneuomonia-like organisms),简
称 T-支原体(T-mycoplasmas) [1]。UU 不具有细胞壁,仅被质膜包围,革兰染色
呈阴性,着色不良,但是吉姆萨或瑞氏染色良好,呈淡紫色。细胞壁的缺失,赋予
了 UU 多形性的特征,其大小可以从 100nm 到 1µm 不等,并且能够自由通过细菌
滤膜。UU 的基因组全长仅 0.75~0.95Mbp 大小 [2],小的基因组限制了 UU 的生物
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合成能力,导致 UU 在体外培养时,营养要求苛刻,尿素是其生长所必需的一种营
养物质。UU 具有一种独特的脲酶,脲酶能够分解尿素生成氨,该过程伴随着质子
电化学电位的升高和 ATP 的合成,UU 生长所需 95%的能量都来源于尿素分解。
也是因为这种独特的脲酶活性,1974 年,UU 被重新归类于支原体科的脲原体属
[3]。不同于其他细菌,UU 在液体培养过程中菌液始终保持澄清透明,不能通过比
较浊度来进行菌量判定,而是依赖于在培养基中添加酚红指示剂,根据菌液颜色变
化进行菌量检测 [4]。液体培养 UU 时,常用颜色变化单位(Color change unit,CCU)
进行 UU 的菌量计数。
2 UU 的分类
早期研究人员通过收集临床 UU 菌株以及各菌株对应宿主的血清,利用抗原
抗体反应,在 UU 中共识别出 14 种血清型,血清型 1~14 [5-7]。2002 年,Roberton
等研究者依据 16S rRNA 序列、16S-23S rRNA 间隔区序列、脲酶基因、多带抗原
的差异,将 UU 区分为两个种群,微小脲原体(Ureaplasma parvum,UPA)和解
脲脲原体(Ureaplasma urealyticum,UUR) [8-10]。UPA 包括血清型 1、3、6 和 14,
UUR 包括血清型 2、4、5 和 7~13。2010 年,Li 等研究员,分别基于 UPA 亚群 4
种血清型菌株的保守序列,UUR 亚群 10 种血清型菌株的保守序列,以及 14 种标
准血清型菌株的特异序列,设计出能够准确分辨 UU 两个种群和 14 种血清型的实
时定量 PCR 方法 [11]。然而,在应用此方法对临床分离 UU 进行分型时,有 6%的
临床菌株 PCR 扩增失败,无法确定血清型 [12]。研究人员对 UU 的 14 株标准血清
型菌株进行全基因组序列分析发现,UU 的基因组具有高度可变性,基因水平转移
(Horizontal gene transfer,HGT)现象在 UU 中普遍存在。研究人员由此推测,UU
很可能是以一种动态群体的方式存在,而非某几种固定的血清型 [2]。2014 年,
Zhang 等研究人员基于 UU 的 4 个管家基因 ftsH、rpL22、valS、thrS 构建了适用于
UU 的多位点序列分型(Multilocus sequence typing,MLST)方法 [13]。UU 的 14 种
标准血清型被识别为 12 个序列型(Sequence type,ST),其 中 UPA1 是 ST1、UPA3
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是 ST2、UPA6 是 ST3、UPA14 是 ST4、UUR2 是 ST5、UUR4 是 ST6、UUR5 和
UUR8 均为 ST7、UUR7 是 ST8、UUR9 和 UUR12 均为 ST9、UUR10 是 ST10、
UUR11 是 ST11、UUR13 是 ST12。随后,为了能够更准确地区分 UU 的 14 种标
准血清型菌株,Zhang 等研究人员在 MLST 方案的基础上,引入了 2 个毒力基因
ureG 与 mba-np1,建立出分辨率更佳的 MLST 扩展方案(Expanded multilocus
sequence typing,eMLST) [14]。UUR5 和 UUR8 以及 UUR9 和 UUR12 被成功区
分,UUR5 对应 eST7,UUR8 对应 eST9,UUR9 对应 eST10,UUR12 对应 eST13。
14 株标准血清型菌株被成功分为 14 种 eST 型。在 269 株女性分离 UU 菌株中,
eMLST 方案共识别出 136 个 eST 型,其中 eST41 和 eST16 是最常见的克隆型 [13]。
在 104 株分离自羊水、脐带和胎盘的 UU 菌株中,eMLST 方案共识别出 34 个 eST
型,eST41 和 eST16 同样是检出最多的克隆型 [15]。
3 UU 感染性疾病
UU 是人类泌尿生殖道常见的共生型微生物,常寄居于人体泌尿生殖道粘膜表
面,大约有 40~80%的性成熟女性宫颈或阴道粘膜可正常携带 UU [16],在 16~44
岁健康男性中 UU 的检出率为 5~15% [17]。UU 可引起多种与泌尿生殖道相关的感
染性疾病,如非淋球菌性尿道炎(Nongonococcal Urethritis,NGU)、不孕不育、
绒毛膜羊膜炎等。如果在妊娠期感染 UU,可导致早产、流产、新生儿肺炎等疾病。
UU 感染器官移植术后,免疫功能低下人群还会引起高氨血症。
3.1 NGU
由于首株 UU 分离自 NGU 患者的尿道分泌物,UU 与 NGU 间的关系引起了
很多研究者的兴趣。1979 年,William 等人提出 UU 很可能是导致非衣原体感染
NGU 的重要致病菌 [18]。1983 年,David 等人报道 UU 感染会在某些患者引起 NGU
[19]。然而,Lee 等人研究发现 UU 在 NGU 男性患者和非尿道炎男性正常人群中的
分布并无差异,由此对 UU 是 NGU 病原菌的身份产生了怀疑 [20]。随着脲原体属
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中 UPA 和 UUR 亚群的区分,研究人员猜测上述争议性的结果可能归因于 UU 不
同亚群菌株间的毒力差异,随后分别研究了 UUR、UPA 与 NGU 的关系。Povlsen
等人发现,在未区分 UPA 和 UUR 时,NGU 患者组与非 NGU 患者组的 UU 分布
无差别。但当分别研究 UPA、UUR 与 NGU 的关系时,发现与 UPA 相比,UUR 更
容易在 NGU 患者中检出 [21]。2007 年,Yoshida 等人报道,在 37 名 NGU 男性患
者中,23 名患者检出 UUR,14 名患者检出 UPA;而在 30 名正常男性患者中,14
名男性检出 UUR,20 名男性检出 UPA。UUR 的检出率在两组人群中存在统计学
差异 [22]。Ondondo 等人发现 26%的 NGU 患者可检出 UUR,而正常人群中 UUR
的检出率仅为 16%;14%的 NGU 患者可检出 UPA,正常人群的检出率为 31% [23]。
Couldwell 等人指出在未检测到其他泌尿道相关病原菌时,UUR 与 NGU 的发生密
切相关 [24]。2014 年,Zhang 等人应用 Meta 分析的方法证实了 Povlsen 等人的研究
[25]。上述研究结果均提示,UUR 很可能是导致 NGU 的病原体
NGU 的发生不仅与感染 UU 的种群相关,还与感染患者的性伴侣个数以及感
染 UU 的菌量相关。2011 年,Wetmore 等人发现 UUR 感染者的性伴侣个数越少,
则发生 NGU 的可能性就越大 [26]。2014 年,Shimada 等人发现感染 UUR 后是否会
发生 NGU,与感染菌量的多少有关,并且菌量越多,发生 NGU 的概率就越大。
同时,患者尿液中白细胞数目也与感染菌量呈正相关 [27]。2016 年,Frolund 等人
进一步证实当尿液中 UUR >1.3103 geq/mL 时,UUR 感染会引起 NGU [28]。然而,
Bradshaw 等研究人员发现无论感染 UPA 还是 UUR 均与 NGU 的发生无关 [29]。
Cox 等研究人员则指出 UPA 在 NGU 患者中有更高的检出率,UUR 与 NGU 的发
生无关 [30]。虽然 UU 感染在 NGU 的作用仍然存在争议,但是大量的研究提示 UU
是 NGU 的病原菌,并且是以 UUR 为主。
3.2 不孕不育
UU 筛查是不孕不育患者的一项重要检查。2009 年,Gupta 等人就曾提出 UU
很可能是原因不明性女性不孕患者的致病菌,并建议对此类患者进行 UU 筛查 [31]。
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有研究表明 UU 在女性不孕患者的检出率高于正常人群 [32]。尽管 Sleha 等人发现
UU 在女性不孕患者中的检出率(39.6%)高于生育能力正常女性人群(34.7%),
但是却未观察到 UU 对女性生殖能力的不良影响 [33]。Piscopo 等人发现子宫颈 UU
的定植与输卵管疾病引起的不孕有关 [34]。Dhawan 等人研究指出 UPA3 和 UPA14
是导致女性生殖道感染和女性不孕的主要血清型 [35]。在特发性不孕女性子宫颈部
UPA3 的检出率为 40%,并且 16%患者的卵泡液中可以同时检出 UPA3 [36]。女性
生殖道支原体的感染还会影响体外受精的成功率 [37]。UU 长期感染泌尿生殖系统,
会刺激宿主的免疫应答反应,释放促炎细胞因子,导致宿主阴道微环境中 IL-6、
IL-8、TNF-α 的升高 [38]。
Zieghami 等人在对 100 名不育男性和 100 名正常生育男性的研究中发现,UU
在不育组和正常对照组的检出率分别为 12%和 3% [39]。Abusarah 等人在对 93 名不
育男性和 70 名正常生育男性的研究中发现,10.8%的不育男性和 5.7%的正常生育
男性 UU 检测阳性 [40]。这些研究均表明,在男性不育患者中,UU 的检出率明显
高于正常生育男性人群。Huang 等人研究发现 UU 阳性者的精液质量明显降低,表
现为精子的活力减低和精子形态的异常,并提出 UU 感染与男性不育的发生有关
[41]。进一步研究发现,UUR 亚群与男性不育的发生存在显著的相关性,但是在 UPA
亚群未观察相关性 [42]。结合 MLST 和 eMLST 分型方案,对 15 对不育夫妇进行
UU 克隆型的分布研究发现,仅 UUR 在夫妻配对组的男性与女性患者间存在一致
性 [43]。由此可见,UUR 更容易通过性传播。UUR 感染会导致精子浓度和精子活
动力的减低 [44]。UU 感染引起男性不育很可能是通过以下机制:UU 粘附于精子
表面,对精子的活动力造成阻碍 [46-49];UU 感染产生有毒代谢产物,从而破坏精
子表面膜结构和 DNA 的断裂 [44,50];UU 中的 UreG 蛋白与精子蛋白之间产生交叉
反应,宿主生成的抗体错误识别精子,造成对精子的破坏 [51]。
3.3 绒毛膜羊膜炎
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1975 年,Shurin 等人首次报道绒毛膜羊膜炎很可能与产前 UU 感染有关 [52]。
对 122 名早产伴胎膜早破患者羊水进行 UU 筛查,发现有 33 名产妇羊水 UU 检测
阳性,在 UU 阳性产妇中高达 87.9%的患者出现了绒毛膜羊膜炎 [53]。与脐带血检
测 UU 阴性孕妇比, UU 阳性孕妇更容易发生绒毛膜羊膜炎 [54]。对于胎膜早破早
产产妇而言,阴道拭子检测 UU 阳性是发生绒毛膜羊膜炎的危险因素 [55]。2016 年,
Sweeney 等人发现,在中晚期早产患者中,UU 单独感染与绒毛膜羊膜炎的发生密
切相关 [56]。研究人员在妊娠 60 天的母羊子宫内注射 UPA3,在妊娠羊胎盘出现绒
毛膜羊膜炎 [57]。上述研究均表明,UU 感染与绒毛膜羊膜炎的发生有关联。然而,
Revello 等人发现大部分羊膜腔内 UU 检测阳性的患者,不会出现组织炎症性的病
理表现 [58]。研究人员通过对孕期恒河猴羊膜腔注射 UPA 和生理盐水的比对分析
发现,羊水内定植的 UPA 虽然会造成宫腔内感染,但是并不会出现明显的绒毛膜
羊膜炎 [59]。上述差异性的研究结果很可能与感染菌株毒力强弱有关,此外,UU 感
染菌量的不同也会造成结果的差异 [60,61]。Sweeney 等人指出大多数 UU 感染与绒
毛膜羊膜炎的研究,纳入对象为早产患者(孕期<32 周),有高达 67%患者的羊水
和胎盘中可以同时检测到至少两种病原微生物(通常是 UU 和其他微生物)。所
以,研究者很难明确地指出 UU 在绒毛膜羊膜炎中的作用 [62]。
3.4 不良妊娠结局
UU 是早产患者羊水或脐带标本中最常检出的微生物。有报道称,早产患者中
UU 的检出率高达 87.0%,明显高于正常生育人群(45.8%) [63]。在对 254 名孕
15~17 周的孕妇筛查中发现 29 名孕妇 UU 检测阳性,在这 29 名 UU 阳性孕妇中,
有高达 58.6%的孕妇会发生早产,而在阴性组早产发生率仅为 4.4% [64]。这些研究
均提示子宫颈 UU 的定植与早产的发生密切相关。动物模型提供了 UU 感染引起
宫内炎症反应和早产的证据。在恒河猴羊膜腔内接种 UPA1,会导致羊水内白细胞
的增多,以及促炎细胞因子、前列腺素 E2、F2和基质金属蛋白酶-9 的上调,从而
导致子宫收缩力的进行性增高,最终诱发早产和分娩 [65]。研究人员在怀孕的雌鼠
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阴道接种 UPA,并使用杀精子剂诱导雌鼠宫颈上皮细胞损伤,发现宫颈上皮损伤
会加速 UU 上行引起的宫内感染,宫内感染的 UPA 会造成促炎细胞因子的上调,
并将早产的概率从 13%提升至 28% [66]。Hassanein 等人发现脐带血检测 UU 阳性
的孕妇更容易发生胎膜早破 [54]。然而,有研究指出羊水中 UU 单独阳性患者早产
伴胎膜早破的发生率与 UU 阴性组无差异 [67]。仅高度 UU 定植(UU≥104 CCU/mL)
与早产有关,而当 UU 菌量<104 CCU/mL 不存在此种关联 [68]。上述差异性结果很
可能与 UU 菌量的不同有关。
Miha 等人对从 77 名早产产妇羊水分离的 UU 菌株进行分群研究发现,高达
82%感染菌株属于 UPA 亚群,仅 18%感染菌株是 UUR [69]。Rittenschober 等人在
对 1316 株分离自孕妇的 UPA 菌株进行血清型分型时,发现 UPA3(43.4%)是孕
妇中最常见的血清型,其次为 UPA6(31.4%),并且与阴性组比,感染 UPA3 的
产妇在孕期(<32 周)发生自发生早产的风险明显升高 [70]。Kong 等人对来源于产
妇和新生儿的 50 组配对 UU 标本进行 eMLST 分型发现,eST16 和 eST41 是优势
克隆株,并且这两个 ST 型均属于 UPA [15]。
研究表明宫内感染诱发早产的机制与先天免疫系统的激活有关。模式识别受
体(如 Toll 样受体)识别 UU,进而激活和释放炎症趋化因子和细胞因子。母胎接
触面的细胞因子能够触发羊膜、绒毛膜、蜕膜和子宫肌层产生并释放前列腺素,导
致子宫收缩、宫颈扩张、胎膜破裂,此外,子宫收缩还会进一步促进细菌感染宫腔
[71]。此外,UU 还可以通过诱发细胞凋亡引起早产 [72]。
3.5 新生儿疾病
UU 是在患有严重细菌感染婴儿体内分离出的第二大常见病原菌,与健康婴儿
相比,UU 更容易在患病儿中检出 [73]。UU 自母亲传染给新生儿的几率高达 90%
[74],可以通过上行感染、血液传播或经过受感染的产道感染 [75]。孕妇产前和围产
期宫内感染造成的不良影响会延伸至整个新生儿期 [76]。妊娠期宫内感染 UU 会造
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成新生儿支气管肺发育不良(bronchopulmonary dysplasia,BPD)、坏死性小肠结肠
炎(necrotizing enterocolitis,NEC)、中枢神经系统损伤等。
1988 年,研究者首次报道了极早产儿下呼吸道 UU 定植与慢性肺病之间的关
系。早期有关呼吸道 UU 定植与 BPD 关系的 Meta 分析指出,伴呼吸道 UU 定植
的早产儿,BPD 的发病率是非 UU 定植早产儿的两倍 [77]。该研究仅分析了出生后
28 天龄早产儿。近期 Meta 分析发现无论是 36 周龄早产儿还是 28 天龄早产儿,呼
吸道UU定植均与BPD的发生有显著相关性 [78]。当产妇UU定植量≥104 CCU/mL,
呼吸道 UU 检测阳性婴儿 BPD 的发生率显著升高 [68]。中重度肺纤维化是 UU 感
染早产儿肺部的病理学特征。有研究显示 UU 感染会促进肺泡巨噬细胞分泌转移
生长因子1,促进成纤维细胞的增殖,从而导致早产儿肺间隔异常、肺间质纤维化
和肺部长时间的强弹性反应 [79]。
除了能够从呼吸道分泌物中分离出 UU,早产儿胃液和直肠的培养物中也都可
以检测到 UU。有研究显示,UU 是一周龄新生儿胃食管部的主要菌群 [80]。在 UPA3
感染妊娠绵羊羊膜腔模型中发现,UPA 暴露的前 7 天,胎羊肠道出现肠绒毛膜上
皮细胞受损和肠屏障缺失的炎症表现。7 天后,胎羊肠上皮细胞的增殖、分化和成
熟程度均明显减低,直至第 14 天出现严重的肠绒毛萎缩 [81]。研究人员证实,早
产儿(<33 周)呼吸道 UU 定植与 NEC 的发生有关联 [82]。
UU 能够穿过新生儿未成熟的血脑屏障,进入到脑脊液。研究人员在婴儿脑组
织中检测到 UU,并提出 UU 可能会引起早产儿中枢神经系统损伤 [83]。UU 感染
所导致的新生儿脑膜炎多见于早产儿,其中很多感染会导致新生儿脑积水、脑室出
血和长期大脑发育障碍 [84]。动物实验证实,产前 UU 暴露会造成胎鼠神经髓鞘形
成延迟、小胶质细胞增生以及神经发育紊乱 [85]。研究证明,UU 能够诱导大脑血
管内皮细胞凋亡,同时对宿主免疫系统进行调节,从而实现在宿主中枢神经系统长
期定植并造成神经系统炎症 [86,87]。
3.6 移植后感染
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UU 感染引起的高氨血症常见于器官移植术后,免疫功能低下患者。有报道称
一名 65 岁的肾移植患者,因 UU 感染导致患者血氨水平达到正常人的 13 倍,并
出现持续的癫痫状态。在接受左氧氟沙星和强力霉素药物治疗后,患者的血氨水平
在 48h 内恢复正常 [88]。此外,也有报道称在肺移植患者的胸膜腔积液和支气管肺
泡液中检测到 UU,该患者临床表现为高氨血症合并脑病 [89]。一名 21 岁接受造血
干细胞移植的急性髓系白血病患者,出现了高氨血症,气道灌洗液检测 UPA 阳性
[90]。有研究报道,供体者器官来源的 UU 能够导致器官移植受体者出现高氨血症
[91],因此,研究人员建议对器官移植者进行早期 UU 筛查,并对筛查阳性者进行
积极治疗,预防因 UU 感染造成器官受体者的高发病率和死亡率 [92]。动物实验证
实,无论是感染 UUR 还是 UPA 均会在免疫抑制小鼠中引起高氨血症 [93,94]。此外,
有报道称在一名 12 岁急性粒细胞白血病患儿的血液、尿液和呼吸道分泌物中检测
到 UPA,该患者临床表现为发热和严重的高氨血症(血氨>1609µmol/L),在接受
针对 UPA 的抗生素治疗后,患儿血氨水平恢复正常,感染症状消退 [95]。一名 32
岁患有 B 细胞急性淋巴细胞白血病的女性,临床表现为持续的高氨血症(血氨浓
度 1643µmol/L),在该患者的血液中检测到 UU [96]。因此,专家建议免疫功能低
下人群一旦出现神经系统症状,应立即进行血氨浓度测定,并且不论是否有肝脏基
础疾病,均建议对患者进行早期的经验性抗生素治疗 [96]。
除了能够引起器官移植接受者高氨血症外,UU 感染还会导致其他的炎症反应。
在一名 20 岁心脏移植患者中,发现 UU 感染导致的进行性尿道炎、肾功能衰竭和
神经系统症状,在使用阿奇霉素和强力霉素联合治疗后,UU 检测呈阴性,患者肾
功能恢复正常,其他炎性症状均消失 [97]。一名 17 岁男性急性淋巴细胞白血病患
者,在接受造血干细胞移植后,出现严重的血尿和阴囊肿胀。尿液 UU 检测阳性,
强力霉素治疗后,病情得到改善 [98]。在一名接受体外受精取卵的患者,发现因 UPA
感染引起的腹膜炎 [99]。在一名 28 岁接受造血干细胞移植的患弥漫性大 B 细胞淋
巴瘤男性患者,发现 UU 感染引起的化脓性关节炎 [100]。一名 19 岁肾移植女性患
者,因 UU 感染造成肾内出现多处脓肿 [101]。上述研究显示,在器官移植术后,免
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疫力低下人群,UU 感染是导致高氨血症的重要原因。除高氨血症外,UU 还会造
成多器官、多部位的感染。
4 UU 的致病机制
与其他致病菌不同,UU 通常不产生毒素,其致病作用多与所携带的致病因子
有关。多带抗原是存在于 UU 表面脂蛋白,也被认为 UU 的主要致病因子。此外,
UU 潜在的毒力因子还包括磷脂酶、免疫球蛋白 A 蛋白酶、O-唾液酸糖蛋白酶、丝
氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶、溶血素、脲酶等。
4.1 磷脂酶
磷脂酶是生物体内广泛存在的一类可以水解甘油磷脂的酶。研究证明磷脂酶
能够破坏细胞膜内的磷脂成分,导致细胞溶解 [102]。UU 包含多种磷脂酶,包括磷
脂酶 A1、A2 和磷脂酶 C。这些磷脂酶主要存在于 UU 的质膜上,并且磷脂酶的活
性在 UU 不同血清型之间存在差异 [103]。UUR8 的磷脂酶 A2 活性是 UUR4 和 UPA3
的三倍以上。然而,研究人员在分析 14 株 UU 标准菌株和 4 株临床分离菌株的全
基因组序列时,却未找到编码磷脂酶 A1、A2 和磷脂酶 C 的基因 [2]。近期,对三株
临床分离 UU 全基因组序列分析的研究也发现了同样的问题 [104]。虽然未找到磷
脂酶 A1、A2 和磷脂酶 C 的编码基因,但是在 UU 的全基因组序列中发现一段与磷
脂酶 D 编码基因相似的序列。研究人员发现,使用早期研究中磷脂酶的检测方法,
磷脂酶 D 会对磷脂酶 A1、A2 和磷脂酶 C 的检测造成干扰,导致检测结果出现假
阳性。因此,研究人员对 UU 中包含磷脂酶 A1、A2 和磷脂酶 C 产生了质疑。但也
有研究者提出可能是由于 UU 的磷脂酶基因在进化过程发生了突变,导致 UU 磷
脂酶基因与其他物种的磷脂酶基因间存在很大差异,所以未能找到同源基因。UU
中是否真的存在磷脂酶 A1、A2 和磷脂酶 C 还有待进一步研究。
4.2 免疫球蛋白 A 蛋白酶
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IgA 蛋白酶能够降解泌尿生殖道黏膜分泌的 IgA 抗体,从而有助于 UU 入侵宿
主的泌尿生殖道上皮细胞。有报道称,在 14 株 UU 标准菌株和临床分离菌株中检
测到 IgA 蛋白酶活性 [105]。然而,Paralanov 等人分析 14 株 UU 标准菌株和 4 株临
床分离菌株的全基因组序列,均未找到编码 IgA 蛋白酶的基因序列 [2]。Glass 等人
也未能在 UPA3 的全基因序列中找到 IgA 蛋白酶的编码序列 [106]。UU 中是否存在
IgA 蛋白酶还需要进一步研究。
4.3 O-唾液酸糖蛋白酶
O-唾液酸糖蛋白酶能够分解人红细胞糖蛋白 A,并且黏膜上皮细胞和巨噬细
胞表面的唾液酸蛋白是该酶的潜在靶点 [107]。Paralanov 等人在对 14 株 UU 标准菌
株的全基因组序列分析中发现,除 UUR2、UUR8 和 UUR10 外,其余 11 种血清型
UU 标准菌株中均包含一个编码 O-唾液酸糖蛋白酶的基因 [2]。但是近期研究人员
发现,菌株 UUR10 中存在一个与 UPA3 中编码 O-唾液酸糖蛋白酶基因相似的基
因序列 [104]。UU 的 O-唾液酸糖蛋白酶很可能与免疫逃逸,在宿主体内定植,并最
终造成感染有关。
4.4 丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶
丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶是一类与信号转导有关的蛋白酶,通过对靶蛋白的
翻译后修饰,调节基因表达,从而影响细菌生长、分裂、铁转运、抗生素耐药性和
细菌毒性 [108]。研究人员发现,与野生型生殖支原体相比,丝氨酸/苏氨酸蛋白磷
酸酶基因缺失的突变株,由于产生过氧化氢的能力减弱,对 HeLa 细胞的毒性也下
降 [109]。研究人员在 UU 的标准菌株和临床菌株中均鉴定出丝氨酸/苏氨酸蛋白磷
酸酶的编码基因 [104],但是该蛋白在 UU 中的作用还有待于进一步研究。
4.5 溶血素
肺炎支原体的溶血素具有产生过氧化氢的活性,能够在宿主细胞膜表面生成
活性氧,从而破坏宿主细胞膜 [110]。过氧化氢酶能够抑制肺炎支原体的溶血素活性,
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但是却无法抑制 UU 的溶血素活性。因此,Glass 等人认为 UU 的溶血素活性与肺
炎支原体的不同。存在于 UU 中的溶血素具有酶活性,能够在细胞膜形成孔道,并
指出溶血素很可能是一种新的毒力因子。与 UU 标准菌株中溶血素的编码序列相
比,临床菌株的溶血素编码基因中出现了数个点突变 [104]。迄今 UU 中溶血素的活
性还未被证实,临床菌株中观察到的点突变是否会影响溶血素的活性,仍待进一步
研究。
4.6 脲酶
脲酶在 UU 的能量代谢和致病性中发挥着重要作用 [111]。脲酶能够将尿素水
解为氨和氨基甲酸,同时生成大量的 ATP。UU 生长所需 95%的能量均来源于尿素
水解。由于 UU 缺乏将氨转化为谷氨酰胺或谷氨酸的酶,导致 UU 的能量代谢伴随
着大量氨的生成,氨的大量积累会造成宿主局部 pH 的升高,慢性组织损伤和病理
性改变 [112]。有研究证实,在缺少免疫反应的条件下,UU 能够通过升高 pH 造成
胎羊的肺部损伤 [112]。UU 的弥散性感染会导致肺移植患者出现严重的高氨血症,
在接受相应的抗生素治疗后,患者体内 UU 检测阴性,血氨水平也随着恢复正常水
平 [113]。UU 的脲酶家族共包含 7 个基因,其中 ureA、ureB 和 ureC 基因编码脲酶
的结构亚基,ureD、ureE、ureF 和 ureG 共同编码构成脲酶的辅助蛋白 [111]。UU
的脲酶基因与大肠杆菌、奇异变形杆菌、肺炎克雷伯菌和产气克雷伯菌中的脲酶基
因有相似的基因排列方式,但是 UU 的脲酶的活性明显高于其他微生物 [114]。比较
基因组学分析发现,UU 的脲酶家族基因在临床菌株中高度保守 [104]。
4.7 生物膜
生物膜是指附着于有生命或无生命物体表面被细菌胞外大分子包裹的有组织
的细菌群体。有报道称自健康人、尿道炎患者、前列腺炎患者尿液中分离的 UU 和
自早产儿呼吸道分泌物分离出的 UU 均能够在体外形成生物膜 [115,116]。这些研究
证实 UU 具有形成生物膜的能力。生物膜的形成可以保护 UU 抵抗宿主的免疫防
104
浙江大学博士学位论文 文献综述
御,有助于 UU 在宿主体内的长期定植或感染。此外,生物膜的形成还赋予 UU 一
定的耐药性。
4.8 多带抗原家族
多带抗原(Multiple banded antigen, MBA)是一种存在于 UU 表面的脂蛋白,
是宿主免疫反应中识别的主要抗原分子。对 14 株 UU 标准菌株的全基因序列分析
发现,MBA 由一个保守的 N 端结构域和一个高度可变的 C 端结构域构成 [2]。保
守的 N 端结构域中包含一个信号肽、一个跨膜结构域和一个脂蛋白附着位点。在
UPA 中,MBA 的 N 端保守序列为 MKS(L)LKNKKFWAMTLGVT;在 UUR 中,
MBA 的 N 端保守序列为 MKLLKNKKFWAITLGVT。MBA 的 C 端具有抗原性,
在 UU 感染期间能够诱导宿主产生免疫反应 [117,118]。C 端可变区通常包含数个串
联重复单元(Tandem repeating units,TRU),TRU 的序列长短不一,短序列 TRU
通常伴随高拷贝数,而长序列 TRU 通常伴随低拷贝数。除了菌株 UUR13 的 C 端
可变区不包含 TRUs,其余 13 种标准血清型菌株的 C 端均包含数目不等的 TRUs。
近期研究发现两株临床分离 UU 菌株的 C 端结构域也同样不包含 TRUs,此外,还
发现一株由于点突变导致 N 端保守序列缺失的临床菌株 [104]。有研究证实,牛支
原体的表面可变脂蛋白 VspC 和 VspF 与牛支原体的细胞粘附相关 [119]。报道称,
肺炎支原体的可变蛋白 Vsa 与其粘附相关 [120]。由于支原体的基因组很小,生物
合成能力有限,因此从宿主获得必要的营养物质对于支原体生长而言至关重要。粘
附是支原体造成感染的第一步,也是支原体进一步存活和致病的首要条件。UU 的
MBA 蛋白具有和 VspC、VspF、Vsa 蛋白相似的结构,因此推测 MBA 很可能在
UU 的细胞粘附中发挥作用。
MBA 可以被宿主细胞的 Toll 样受体(Toll-like receptors, TLR),TLR1、TLR2
和 TLR6 识别,通过激活 NF-B,诱导宿主产生细胞因子 [121]。UU 能够通过改变
MBA 的表达状态,实现对宿主免疫防御的逃逸,从而达到在宿主体内长期定植或
感染的目的。MBA表达状态的改变主要通过两种机制,一种是通过发生滑移突变,
105
浙江大学博士学位论文 文献综述
导致 MBA 蛋白 C 端 TRU 数目的改变,另一种是通过基因重组,mba 与周围基因
发生融合,形成新的重组基因。Knox 等人将 UPA3 和 UPA6 分别接种到妊娠母羊
体内,感染一段时间后,使用 PCR 和蛋白免疫印迹法检测母羊体内 UU 菌株的
MBA,发现感染菌株的 MBA 在基因水平和蛋白质水平均发生了变异。PCR 结果
显示,用 mba 上游引物扩增得到单条序列,并且序列和 UPA3 一致,而用 mba 下
游引物扩增得到多个条带。同时,针对 MBA 的蛋白免疫印迹结果也表现为多个蛋
白条带,并且蛋白条带数目与 PCR 检测到的条带数目保持一致 [122]。研究人员因
此提出,MBA 在宿主体内的变异与 mba 下游的 TRU 有关。Knox 等人还发现羊水
中检测到的 MBA 变异体个数和妊娠羊绒毛膜羊膜炎的炎症程度有关,当 MBA 变
异体个数≥9 时,妊娠羊的绒毛膜未观察到组织学炎症病变;而当 MBA 变异体个
数≤5 时,妊娠羊的绒毛膜观察到严重的炎症病变,组织形态学改变以及组织结构
的严重缺失 [122]。研究证实无论是无毒株 UU 或者强毒力 UU 菌株,感染宿主后,
在宿主体内均会产生 MBA 分子量的变异,但是强毒力 UU 菌株 MBA 分子量的变
异范围比无毒力 UU 变异范围更广,并且在不同毒力 UU 感染宿主的羊膜组织均
观察到 IL-1β、IL-6 和 IL-8 表达水平的上升 [123]。Emma 等人首次在自临床产妇胎
盘分离的 UU 菌株检测到 MBA 分子量的变异,他们发现感染的 UU 菌株未出现
MBA 变异的孕妇往往表现为严重的绒毛膜羊膜炎,并且脐带血中细胞因子 IL-8 和
G-CSF 的含量也很高。随后,他们通过体外试验证实,不同蛋白分子量的重组 MBA
会刺激巨噬细胞产生不同表达量的 NF-B p65 和不同水平的细胞因子 [124]。研究
证实,在急性 UU 感染(<3 天),不会出现 MBA 变异或仅观察到轻微 MBA 变异
(感染第 7 天),在慢性感染(>69 天)则观察到明显的 MBA 变异,并且 MBA
变异程度与感染时间呈正相关 [112]。上述研究证实,UU 能够通过改变 MBA 下游
TRU 的数目产生很多 MBA 变异体,从而实现宿主免疫逃逸。
多种支原体膜表面可变蛋白可以发生表达状态的改变,如牛支原体的 Vsp 蛋
白 [125],肺炎支原体的 Vsa 蛋白 [126],无乳支原体的 Vpma 蛋白 [127]。体外研究证
实,UU 在选择性 MBA 抗体的压力下,会暂时性地关闭 MBA 蛋白的表达 [128]。
106
浙江大学博士学位论文 文献综述
Zimmerman 等人进一步研究证明,在选择性抗体的压力下,UU 会产生逃逸突变,
关闭靶蛋白的表达,同时表达一个不包含靶向位点的蛋白,如 Upvmp376。
Upvmp376 蛋白的表达与基因重组有关,MBA 非重复区和邻近的基因间区发生基
因倒置,然后再与周围基因融合产生一个新的蛋白 [129]。对 14 株标准血清型 UU
菌株的全基因组序列分析发现,在 UPA 菌株 N 端保守序列的两端存在一段反向重
复序列,并且在反向反向重复序列内发现一个长度为 25bp 的重组酶识别位点 [2]。
Zimmerman 等人指出 UPA3 的 DNA 倒置突变很可能是由酪氨酸重组酶 XerC 调
控,并用实验证明了酪氨酸重组酶 XerC 的重组活性 [130,131]。对 MBA 家族基因序
列的比较分析发现,MBA 的 C 端可变区也可以发生 DNA 倒置 [104]。通过基因重
组造成 MBA 表达状态的改变,也被认为是 UU 实现宿主免疫逃逸的一种机制。
5 总结
UU 与多种临床感染性疾病有关,如非淋球菌性尿道炎、不孕不育、绒毛膜羊
膜炎、不良妊娠结局、新生儿支气管肺发育不良、坏死性小肠结肠炎和中枢神经系
统损伤、高氨血症等。由于人群中有很大一部分 UU 感染者表现为无症状携带,
UU 在上述疾病中的致病作用仍然存有争议。UU 感染是否会导致疾病主要与感染
UU 的种群,菌量,以及宿主免疫状态有关。UPA 多见于正常人群,而 UUR 的致
病力比 UPA 强,多见于患病人群。UU 的致病机制与其所携带的致病因子有关,
多带抗原和脲酶是 UU 的主要毒力因子。此外,磷脂酶、免疫球蛋白 A 蛋白酶、
O-唾液酸糖蛋白酶、丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶、溶血素等也被认为是 UU 的潜在
毒力因子。
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123
浙江大学博士学位论文 个人简介及在读期间取得的科研成果
作者简介及在读期间取得的科研成果
1. 作者简历
杨婷,女,27 岁。2010 年 9 月至 2015 年 7 月就读于山西医科大学汾阳学院
医学检验专业,获医学学士学位;2015 年 9 月至今就读于浙江大学医学院临床检
验诊断学专业,直接攻读科学博士学位。
2. 科研成果
本人在读博期间主要从事脲原体流行病学和致病机制的研究,共参与发表 SCI
论文 6 篇,其中第一作者论文 3 篇,共同第一作者论文 1 篇,第二作者论文 1 篇,
第五作者论文 1 篇。
1) Yang T, Pan LL, Wu NN, Wang L, Liu Z, Kong YY, Ruan Z, Xie XY*, Zhang J*.
Antimicrobial resistance in clinical Ureaplasma spp. and Mycoplasma hominis and
structural mechanisms underlying the quinolone resistance. Antimicrob Agents
Chemother. 2020, 64(6): e02560-19.(IF: 4.715)
2) Yang T, Li XH, Zhang Y, Kong YY, Yu H, Ruan Z, Xie XY*, Zhang J*. Comparative
genomics of three clinical Ureaplasma species: analysis of their core genomes and
multiple-banded antigen locus. Future Microbiol. 2020, 15: 49-61.(IF: 2.746)
3) Yang T, Zou YP, Zhou WL, Ruan Z, Kong YY, Zhou YH*, Zhang J*, Xie XY*.
Clonal diversity of Ureaplasma species and its relationship with oligozoospermia
and semen quality in Chinese infertile males. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2018,
37(10): 1957-1963.(IF: 2.591)
4) Kong YY#, Yang TT#, Yang T#, Ruan Z, Song TJ, Ding HH, Xie XY*, Zhang J*.
Correlation between Ureaplasma spp. sub-group 1 and preterm pre-labour rupture of
124
浙江大学博士学位论文 作者简介及在读期间取得的科研成果
membranes revealed by an eMLST scheme. Infect Genet Evol. 2019, 68: 172-176.
(IF: 2.611, #共同第一作者)
5) Ruan Z, Yang T, Shi XY, Kong YY, Xie XY*, Zhang J*. Clonality and distribution
of clinical Ureaplasma isolates recovered from male patients and infertile couples in
China. PLoS One. 2017, 12(8): e0183947.(IF: 2.776)
6) Jin H, Xu XP, Huang CY, Ruan Z, Yang T, Kong YY, Xie XY*, Zhang J*. Genomic
characterization of a multidrug-resistant Mycoplasma hominis recovered from a
synovial fluid sample in China. J Glob Antimicrob Resist. 2020, 20: 282-284.(IF:
2.469)

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