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携载化疗药物的肿瘤靶向性纳米 CT 造影剂

时间:2022-05-17来源:EMBA论文

目的:随着医疗的发展,人类生活水平的提高,很多曾经威胁人类的疾病都已 不再是难题,但近年来,肿瘤疾病仍然严重威胁着人类的健康。由于传统的抗 肿瘤药物选择性差,所谓杀敌一千自损八百,不仅杀伤肿瘤细胞,人体正常细 胞也会受损,常常产生严重的全身性毒副作用。因此,目前急需寻找一种高选 择性的,并能实现肿瘤诊疗一体化的智能药物载体。计算机断层扫描(CT)是 目前临床上广泛应用的非侵入性成像诊断技术之一,需要借助 CT 造影剂来增强 软组织的对比度。在提高造影剂的成像性能和降低副作用方面,临床学者和造 影剂开发商经历了数十年的不断探索,大量研究集中于将临床应用的碘代小分 子发展成碘代纳米粒子,此外,一些研究将具有高吸收 X 线性能的金属和无机 纳米粒子引入碘造影剂,用以增加其对比性能。如金元素由于具有比碘高的原 子序数,以及对 X 线衰减贡献较大的光电效应,受到广泛关注。本研究是制备 多功能金掺杂含碘纳米粒子 X 线 CT 造影剂,同时可作为抗肿瘤药物载体,实 现对肿瘤细胞的精准诊疗。 内 容 : 通 过 多 重 步 骤 成 功 制 备 了 多 功 能 金 掺 杂 含 碘 聚 合 物 纳 米 粒 子 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP。其中包括含碘单体化合物的合成,含碘 纳米粒子的制备并将其表面氨基化,引入叶酸分子(FA),最后在其表面沉积金 纳米粒子等。采用透射电镜(TEM)、紫外-可见分光光谱仪(UV-vis)、傅里叶 红外光谱仪(FT-IR)等对其表面形貌和结构进行表征;采用激光粒度仪表征各 步产物纳米粒子在溶液中的粒径和电位变化;通过考察其 X 线衰减性能评价其 作为 CT 造影剂的性能;通过载药释药实验评价其作为药物载体的性能;通过细 胞吸收和细胞毒性实验对该纳米聚合物进行体外研究。 方法:本研究利用沉淀聚合法合成了形貌规则、粒径均匀的金掺杂含碘聚合物 纳米粒子 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP。首先,以 2-甲基丙烯酰(3- 酰胺-2, 4, 6-三碘苯甲酸)(MATIB)为单体,以 N,N’-亚甲基双丙烯酰胺(MBA) 为交联剂,合成交联的聚合物纳米粒子 P(MATIB-co-MBA),同时通过加入甲基 丙烯酸缩水甘油酯(GMA)引入环氧基;第二阶段用乙二胺 EDA 修饰聚合物纳 米粒子 P(MATIB-co-MBA-co-GMA),使其表面氨基化;随后 FA 作为肿瘤靶向 分子被修饰到该纳米粒子表面,以增加其主动摄取率;最后,在上步所得纳米 粒子表面原位沉积金纳米粒子 AuNP,即合成具有肿瘤靶向性 X 线 CT 造影剂和 I 天津医科大学硕士学位论文 抗 肿 瘤 药 物 传 递 的 多 功 能 金 掺 杂 含 碘 纳 米 粒 子 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP。 接下来,本研究对实验各步所得到的聚合物纳米粒子进行了全方位的表征。 首先,采用 TEM 和激光粒度仪表征其表面形貌、粒径及粒径分布和 Zeta 电位等。 采用 FT-IR 和 UV-vis 表征其结构,考察 FA 分子被修饰到聚合物纳米粒子表面的 情况。采用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)表征各部产物中碘(I)含量和金 (Au)含量。 通过该聚合物纳米粒子对抗肿瘤药物盐酸阿霉素(DOX)的负载和体外释 放实验,评价其作为药物载体的性能。采用激光共聚焦荧光显微镜和流式细胞 分析仪考察该聚合物纳米粒子在负载抗肿瘤药物 DOX 后的体外细胞吸收情况和 药物传递能力,考察其对人乳腺癌细胞 MCF-7 肿瘤细胞的靶向性,通过 MTT 实验考察负载 DOX 的聚合物纳米粒子对 MCF-7 的细胞毒性。 结果:TEM、FT-IR、UV-vis、元素分析和粒径电位分析仪表征的结果均表征了 含碘聚合物纳米粒子 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 的成功制备。TEM 图片结果显示,所得聚合物纳米粒子均为形状规则、大小均一的球形,且分散 性良好,P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 的平均粒径约为 135 nm。电位 分 析 仪 显 示 纳 米 粒 子 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-EDA 比 纳 米 粒 子 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)的 Zeta 电位明显偏正向移动,说明乙二胺 EDA 成 功连接到聚合物纳米粒子 P(MATIB-co-MBA-co-GMA),使其表面氨基化。UV-vis 显示,在修饰 FA 分子后,在 304 nm 处出现了 FA 分子相对应的吸收峰,相比游 离 FA 分子在 280 nm 处的吸收峰红移了 24 nm,FA 分子又被成功连接到 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-EDA 纳米粒子上。 体外 X 线 CT 成像检测结果表明,AuNP 的掺杂使该纳米粒子的 X 线衰减性 能明显增强。载药实验结果表明,该聚合物纳米粒子对抗肿瘤药物 DOX 的载药 量可达到 51.3%,对应的包封率为 34.2%。体外释药实验结果表明,该负载 DOX 的纳米粒子在 pH 6.0 的磷酸缓冲(PBS)溶液中 DOX 释放速率明显高于在 pH 7.4 的缓冲溶液中的释放速率,说明 DOX 在该纳米粒子中的释放具有一定的 pH 响 应性。 激光共聚焦荧光显微镜和流式细胞分析仪检测结果均表明,负载 DOX 的聚 合物纳米粒子 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 处理组可观察到红色的 DOX 荧 光 强 度 明 显 强 于 负 载 DOX 的 纳 米 粒 子 II 天津医科大学硕士学位论文 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-AuNP 处 理 组 , 这 说 明 该 聚 合 物 纳 米 粒 子 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 还具有主动靶向性。细胞毒性实验结果表 明,该 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 聚合物纳米粒子在低于 100 μg/mL 时未表现出明显的细胞毒性。相比没有叶酸修饰的纳米粒子,有 FA 修饰的纳米 粒子能更好的携载抗肿瘤药物进入肿瘤细胞,对肿瘤细胞具有更好的杀伤性能。 结论:本实验制备的 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 聚合物纳米粒子粒 径均匀,性质稳定,具有可控释药特性,并且低毒。有 FA 修饰的纳米粒子能更 好的携载抗肿瘤药物进入肿瘤细胞,具有更精准的杀伤性能。同时,X 线 CT 成 像检测结果表明 AuNP 的掺杂使该纳米粒子的 X 线衰减性能明显增强。该多功 能金掺杂含碘纳米粒子有潜力成为 X 线 CT 造影剂和肿瘤靶向性抗肿瘤药物载 体,实现对肿瘤细胞的精准诊疗。
沉淀聚合; 肿瘤靶向; CT 造影剂; 金纳米粒子; 药物输送
    目的:随着医疗的发展,人类生活水平的提高,很多曾经威胁人类的疾病都已
不再是难题,但近年来,肿瘤疾病仍然严重威胁着人类的健康。由于传统的抗
肿瘤药物选择性差,所谓杀敌一千自损八百,不仅杀伤肿瘤细胞,人体正常细
胞也会受损,常常产生严重的全身性毒副作用。因此,目前急需寻找一种高选
择性的,并能实现肿瘤诊疗一体化的智能药物载体。计算机断层扫描(CT)是
目前临床上广泛应用的非侵入性成像诊断技术之一,需要借助 CT 造影剂来增强
软组织的对比度。在提高造影剂的成像性能和降低副作用方面,临床学者和造
影剂开发商经历了数十年的不断探索,大量研究集中于将临床应用的碘代小分
子发展成碘代纳米粒子,此外,一些研究将具有高吸收 X 线性能的金属和无机
纳米粒子引入碘造影剂,用以增加其对比性能。如金元素由于具有比碘高的原
子序数,以及对 X 线衰减贡献较大的光电效应,受到广泛关注。本研究是制备
多功能金掺杂含碘纳米粒子 X 线 CT 造影剂,同时可作为抗肿瘤药物载体,实
现对肿瘤细胞的精准诊疗。
内 容 : 通 过 多 重 步 骤 成 功 制 备 了 多 功 能 金 掺 杂 含 碘 聚 合 物 纳 米 粒 子
P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP。其中包括含碘单体化合物的合成,含碘
纳米粒子的制备并将其表面氨基化,引入叶酸分子(FA),最后在其表面沉积金
纳米粒子等。采用透射电镜(TEM)、紫外-可见分光光谱仪(UV-vis)、傅里叶
红外光谱仪(FT-IR)等对其表面形貌和结构进行表征;采用激光粒度仪表征各
步产物纳米粒子在溶液中的粒径和电位变化;通过考察其 X 线衰减性能评价其
作为 CT 造影剂的性能;通过载药释药实验评价其作为药物载体的性能;通过细
胞吸收和细胞毒性实验对该纳米聚合物进行体外研究。
方法:本研究利用沉淀聚合法合成了形貌规则、粒径均匀的金掺杂含碘聚合物
纳米粒子 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP。首先,以 2-甲基丙烯酰(3-
酰胺-2, 4, 6-三碘苯甲酸)(MATIB)为单体,以 N,N’-亚甲基双丙烯酰胺(MBA)
为交联剂,合成交联的聚合物纳米粒子 P(MATIB-co-MBA),同时通过加入甲基
丙烯酸缩水甘油酯(GMA)引入环氧基;第二阶段用乙二胺 EDA 修饰聚合物纳
米粒子 P(MATIB-co-MBA-co-GMA),使其表面氨基化;随后 FA 作为肿瘤靶向
分子被修饰到该纳米粒子表面,以增加其主动摄取率;最后,在上步所得纳米
粒子表面原位沉积金纳米粒子 AuNP,即合成具有肿瘤靶向性 X 线 CT 造影剂和
I
天津医科大学硕士学位论文
抗 肿 瘤 药 物 传 递 的 多 功 能 金 掺 杂 含 碘 纳 米 粒 子
P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP。
接下来,本研究对实验各步所得到的聚合物纳米粒子进行了全方位的表征。
首先,采用 TEM 和激光粒度仪表征其表面形貌、粒径及粒径分布和 Zeta 电位等。
采用 FT-IR 和 UV-vis 表征其结构,考察 FA 分子被修饰到聚合物纳米粒子表面的
情况。采用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)表征各部产物中碘(I)含量和金
(Au)含量。
通过该聚合物纳米粒子对抗肿瘤药物盐酸阿霉素(DOX)的负载和体外释
放实验,评价其作为药物载体的性能。采用激光共聚焦荧光显微镜和流式细胞
分析仪考察该聚合物纳米粒子在负载抗肿瘤药物 DOX 后的体外细胞吸收情况和
药物传递能力,考察其对人乳腺癌细胞 MCF-7 肿瘤细胞的靶向性,通过 MTT
实验考察负载 DOX 的聚合物纳米粒子对 MCF-7 的细胞毒性。
结果:TEM、FT-IR、UV-vis、元素分析和粒径电位分析仪表征的结果均表征了
含碘聚合物纳米粒子 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 的成功制备。TEM
图片结果显示,所得聚合物纳米粒子均为形状规则、大小均一的球形,且分散
性良好,P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 的平均粒径约为 135 nm。电位
分 析 仪 显 示 纳 米 粒 子 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-EDA 比 纳 米 粒 子
P(MATIB-co-MBA-co-GMA)的 Zeta 电位明显偏正向移动,说明乙二胺 EDA 成
功连接到聚合物纳米粒子 P(MATIB-co-MBA-co-GMA),使其表面氨基化。UV-vis
显示,在修饰 FA 分子后,在 304 nm 处出现了 FA 分子相对应的吸收峰,相比游
离 FA 分子在 280 nm 处的吸收峰红移了 24 nm,FA 分子又被成功连接到
P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-EDA 纳米粒子上。
体外 X 线 CT 成像检测结果表明,AuNP 的掺杂使该纳米粒子的 X 线衰减性
能明显增强。载药实验结果表明,该聚合物纳米粒子对抗肿瘤药物 DOX 的载药
量可达到 51.3%,对应的包封率为 34.2%。体外释药实验结果表明,该负载 DOX
的纳米粒子在 pH 6.0 的磷酸缓冲(PBS)溶液中 DOX 释放速率明显高于在 pH 7.4
的缓冲溶液中的释放速率,说明 DOX 在该纳米粒子中的释放具有一定的 pH 响
应性。
激光共聚焦荧光显微镜和流式细胞分析仪检测结果均表明,负载 DOX 的聚
合物纳米粒子 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 处理组可观察到红色的
DOX 荧 光 强 度 明 显 强 于 负 载 DOX 的 纳 米 粒 子
II
天津医科大学硕士学位论文
P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-AuNP 处 理 组 , 这 说 明 该 聚 合 物 纳 米 粒 子
P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 还具有主动靶向性。细胞毒性实验结果表
明,该 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 聚合物纳米粒子在低于 100 μg/mL
时未表现出明显的细胞毒性。相比没有叶酸修饰的纳米粒子,有 FA 修饰的纳米
粒子能更好的携载抗肿瘤药物进入肿瘤细胞,对肿瘤细胞具有更好的杀伤性能。
结论:本实验制备的 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 聚合物纳米粒子粒
径均匀,性质稳定,具有可控释药特性,并且低毒。有 FA 修饰的纳米粒子能更
好的携载抗肿瘤药物进入肿瘤细胞,具有更精准的杀伤性能。同时,X 线 CT 成
像检测结果表明 AuNP 的掺杂使该纳米粒子的 X 线衰减性能明显增强。该多功
能金掺杂含碘纳米粒子有潜力成为 X 线 CT 造影剂和肿瘤靶向性抗肿瘤药物载
体,实现对肿瘤细胞的精准诊疗。
关键词 沉淀聚合; 肿瘤靶向; CT 造影剂; 金纳米粒子; 药物输送
III
天津医科大学硕士学位论文
Abstract
Objective: With the development of medical care and the improvement of human
living standards, many diseases that once threatened people are no longer a problem.
But in recent years, tumor diseases still pose a serious threat to human health. The
selectivity of traditional antitumor drugs is poor, the so-called kill one thousand self
harm eight hundreds will be generated. The cancer cells are not only killed, but the
normal cells are also damaged, which often lead to serious systemic toxicities and
side effects. Therefore, it is urgent to find an intelligent drug carrier which is highly
selective and can realize the integration of tumor diagnosis and treatment. Computed
tomography (CT) is one of the non-invasive imaging diagnostic techniques widely
used in clinical practice, and the contrast of soft tissue should be enhanced by using
CT contrast agent. To improve the imaging performance of the contrast agent and
reduce their side effects, clinical academics and contrast agent developer have
explored continuously for several decades. A large amount of researches focused on
the developments from iodine substituted small molecules in clinical application into
nano-sized iodinated CT contrast agents. In addition, to increase their contrast, some
metal and inorganic nanoparticles with high X-ray absorption performance were
introduced into the researches of X-ray CT contrast agent. For example, gold
nanoparticles have been researched extensively due to their high atomic number and
their high X-ray attenuation effect. In this work, the multifunctional iodine-containing
nanoparticles with Au doping were prepared for using as X-ray CT contrast agents
and antitumor drug carriers to achieve accurate diagnosis and treatment of tumor
cells.
Content : The multifunctional iodine-containing nanoparticles
P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP were successfully prepared by multiple
steps, including the synthesis of iodine-containing monomer compounds, the
preparation of the crosslinked iodine-containing nanoparticles, the surface
modification with amino groups, the conjugation of folic acid (FA) molecules, and the
gold nanoparticles depositing in situ. The morphologies and structures of the
nanoparticles were characterized by using transmission electron microscopy (TEM),
IV
天津医科大学硕士学位论文
ultraviolet-visible spectrophotometer (UV-vis) and fourier infrared spectrometer
(FT-IR). Their sizes and zeta potentials were measured in water using a laser
scattering spectrometer. Their performances used as CT contrast agent were evaluated
by investigating their X-ray attenuation effects. Their performances used as drug
carriers were evaluated via investigating their drug loading and releasing. The cellular
uptakes and cytotoxicities of the nanoparticles were investigated in vitro.
Methods: In this study, the iodine-containing polymer nanoparticles
P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP were synthesized via precipitation
polymerization. First of all, the crosslinked polymer nanoparticles
P(MATIB-co-MBA) were prepared with 2-methacryl(3-amide-2,4,6-triiodobenzoic
acid) (MATIB) as monomers and N,N-methylenebis(acrylamide) (MBA) as
crosslinker. Glycidyl methacrylate (GMA) as comonomers were added in the
meantime to introduce epoxy groupson the surface of the nanoparticles. In the second
stage, the surfaces of P(MATIB-co-MBA-co-GMA) nanoparticles were introduced
amino groups by the ring-opening reaction with EDA. Subsequently, FA as tumor
target molecules were modified onto the surface of the nanoparticles via the
formation of amide linkages between the amino groups on the surface of
nanoparticles and the carboxylic acid groups of FA to increase theactive uptake of
nanoparticles. Finally, the gold nanoparticles were deposited on the generated
nanoparticles P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA in situ. Thus multifunctionalized
iodine-containing nanoparticles with Au doping were prepared to use as X-ray CT
contrast agent and anti-cancer drug carriers with tumor targeting for tumor diagnosis
and treatment.
 Next, the comprehensive characterizations of the polymer nanoparticles obtained
from each step were given. Firstly, TEM was used to characterize their surface
morphologies, particle sizes and particle size distributions. The FT-IR spectra and
UV-vis spectra were used to characterize their structures. The particle sizes in
solution and the zeta potentials of the nanoparticles were characterized by a laser
scattering spectrometer. The content of I and Au in the nanoparticles were measured by inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS).
V
天津医科大学硕士学位论文
Their performances used as drug carriers were evaluated by investigating the
loading and releasing of the antitumor drug doxorubicin hydrochloride (DOX). The
targeted cellular uptake sand drug delivery propertity of the
P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP nanoparticles were investigated using breast
cancer cells (MCF-7) in vitro by confocal fluorescence microscope and flow
cytometryassay. The cytotoxicity of DOX loaded
P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP nanoparticles were investigated by MTT
assay.
Results: From the results of TEM, FT-IR spectra, UV-vis spectra, size and size
distribution, and zeta potential, the iodine-containing nanoparticles
P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP were prepared successfully. From the
observation of TEM images, the nanoparticles from each step had regular spherical
shape, uniform size and good dispersity. The average size of
P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP nanoparticles is about 135 nm. Compared to
that of P(MATIB-co-MBA-co-GMA) nanoparticles, the zeta potential of the
P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-EDA nanoparticles changed to positive charging from
the results of particle analyser, which indicated that the EDA was successfully
modified on the surface of P(MATIB-co-MBA-co-GMA) nanoparticles.
 The strong peak at 280 nm which attributed to the characteristic absorbance of
FA molecule was shifted to 304 nm in the UV–vis spectrum of
P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP nanoparticles, suggested that FA molecules
was successfully connected to the P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-EDA nanoparticles.
The results of in vitro X-ray CT imaging showed that the X-ray attenuation effect of
the nanoparticles doping with AuNP was significantly enhanced. The experimental
results of drug loading showed that the DOX loading capacity of the
P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP nanoparticles could reach 51.3%, and the
corresponding encapsulation rate was 34.2%. The DOX release rate in pH 6.0
phosphate buffer solution (PBS) was significantly higher than that in pH 7.4 buffer
solution. The results showed that the DOX release from the nanoparticles was dependent on pH values.
VI
天津医科大学硕士学位论文
The results from laser confocal fluorescence microscopy and flow cytometry
analyzer showed that the fluorescence intensity of the tumor cells treated with
DOX-loaded P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP nanoparticles was obviously
higher than that of the tumor cells treated with DOX loaded
P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-AuNP nanoparticles, indicating the targeted delivery
of DOX by the P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP nanoparticles. The results of
cytotoxicity experiment showed that the P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP
nanoparticles showed no obvious toxicity at less than 100 µg/mL. Compared to the
nanoparticles without FA modification, the nanoparticles with FA modification could
carry more anti-tumor drugs into tumor cells and kill tumor cells more effectively.
Conclusion : The P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP nanoparticles with
uniform size and good stability were prepared. The drug-loaded nanoparticles
exhibited the targeted drug delivery in tumor cells, pH-dependent controlled release
and low cytotoxicity. In vitro drug delivery study indicated that the FA-conjugated
nanoparticles could deliver DOX into MCF-7 cells more efficiently than the
nanoparticles without functionalization of FA. And the DOX-loaded
P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP nanoparticles showed more efficient for
killing tumor cells than that of P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-AuNP nanoparticles.
The results of X-ray CT imaging showed that the X-ray attenuation effect of the
nanoparticles doping with AuNP was significantly enhanced. The multifunctional
iodine-containing nanoparticles with Au doping have potential to be using as X-ray
CT contrast agents and antitumor drug carriers to achieve accurate diagnosis and
treatment of tumor cells.
Key words:Precipitation polymerization; Tumor targeting; CT contrast agent; Gold
nanoparticles; Drug delivery
VII
天津医科大学硕士学位论文
目录
中文摘要 ........................................................................................................................I
Abstract........................................................................................................................IV
目录 .......................................................................................................................... VIII
缩略语 .......................................................................................................................... X
前言 ...............................................................................................................................1
研究现状、成果 ....................................................................................................1
研究目的、方法 ....................................................................................................5
一、纳米粒子的制备及表征 .....................................................................................10
1.1 仪器与试剂 ...................................................................................................10
 1.1.1 仪器 .....................................................................................................10
 1.1.2 试剂 .....................................................................................................10
1.2 实验方法 .......................................................................................................11
1.2.1 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 纳米粒子的制备 ...............11
1.2.2 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 纳米粒子的表征 ...............12
1.2.3 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 纳米粒子的 CT 造影性能考
查 ...................................................................................................................13
1.3 结果 ...............................................................................................................14
1.3.1 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 纳米粒子的表征 ...............14
1.3.2 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 纳米粒子的体外 X 线衰减性
能 ...................................................................................................................17
1.4 讨论 ...............................................................................................................18
1.4.1 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 纳米粒子的制备和表征 ...18
1.4.2 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 纳米粒子的体外 X 线衰减性
能 ...................................................................................................................20
1.5 小结 ...............................................................................................................21
二、纳米粒子的载药及释药性能研究 .....................................................................22
2.1 仪器与试剂 ...................................................................................................22
 2.1.1 仪器 .....................................................................................................22
 2.1.2 试剂 .....................................................................................................22
2.2 实验方法 .......................................................................................................22
2.2.1 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 纳米粒子的载药性能研究
 .......................................................................................................................22
2.2.2 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 纳米粒子的体外释药性能研
究 ...................................................................................................................23
2.3 结果 ...............................................................................................................23
2.3.1 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 纳米粒子载药性能研究 ...23
VIII
天津医科大学硕士学位论文
 2.3.2 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 纳米粒子体外释药性能研
 究 ...................................................................................................................24
2.4 讨论 ...............................................................................................................25
 2.4.1 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 纳米粒子载药性能研究 ...25
 2.4.2 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 纳米粒子体外释药性能研究
 .......................................................................................................................26
2.5 小结 ...............................................................................................................27
三、纳米粒子的细胞毒性及细胞吸收性能研究 .....................................................28
3.1 仪器与试剂 ...................................................................................................28
 3.1.1 仪器 .....................................................................................................28
 3.1.2 试剂 .....................................................................................................28
3.2 实验方法 .......................................................................................................28
3.2.1 MCF-7 细胞的复苏、培养及冻存 .....................................................28
3.2.2 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 纳米粒子的细胞毒性研究
 .......................................................................................................................29
3.2.3 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 纳米粒子的体外靶向性研究
.......................................................................................................................30 3.3 结果 ...............................................................................................................31
3.3.1 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 纳米粒子的细胞毒性研究
 .......................................................................................................................31
3.3.2 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 纳米粒子的细胞吸收和体外
靶向性能研究 ...............................................................................................33
3.4 讨论 ...............................................................................................................35
3.4.1 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 纳米粒子的细胞毒性研究
 .......................................................................................................................35
3.4.2 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 纳米粒子的体外靶向性研究
 .......................................................................................................................37
3.5 小结 ...............................................................................................................37
结论 .............................................................................................................................39
参考文献 .....................................................................................................................41
发表论文及参加科研情况说明 .................................................................................46
综述 .............................................................................................................................47
综述参考文献 ......................................................................................................74
致谢 .............................................................................................................................84
个人简历 .....................................................................................................................85
IX
天津医科大学硕士学位论文
缩略语
英文缩写 英文全称 中文全称
AIBN 2, 2'-Azobisisobutyronitrile 偶氮二异丁腈
AuNP Gold nanoparticles 金纳米粒子
Dh Hydrodynamic diameter 水力直径
DMEM Dulbecco's modified eagle medium 细胞培养基
DMSO Dimethyl sulfoxide 二甲基亚砜
DOX Doxorubicin hydrochloride 盐酸阿霉素
EDA Ethylenediamine 乙二胺
EDC 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide
hydrochloride 1-(3-二甲氨基丙
基)-3-乙基碳二亚胺
盐酸盐
EPR Enhanced permeability and retention 高通透性和滞留
FA Folic acid 叶酸
FBS Fetal bovine serum 胎牛血清
FT-IR Fourier transform infrared spectrometer 傅里叶变换红外
光谱仪
GMA Glycidyl methacrylate 甲基丙烯酸缩水
甘油酯
MAA Methacrylic acid 甲基丙烯酸
MATIB 2-Methacryl(3-amide-2, 4, 6-triiodobenzoic
acid) 2-甲基丙烯酰(3-酰
胺-2,4,6-三碘苯
甲酸)
MBA N,N'-Methylenebisacrylamide N,N’-亚甲基双丙烯
X
天津医科大学硕士学位论文
酰胺
MTT Methyl thiazolyl tetrazolium 四甲基偶氮唑盐
MCF-7 Human breast cancer cell MCF-7 人乳腺癌细胞
NHS N-Hydroxysuccinimide N-羟基琥珀酰亚胺
PBS Phosphate buffer saline 磷酸缓冲盐溶液
PDI Polymer dispersion index 聚合物分散指数
TEM Transmission electron microscope 透射电子显微镜
UV-vis Ultraviolet-visible absorption spectrometer 紫外-可见吸收
光谱仪
XI
天津医科大学硕士学位论文
前言
研究现状、成果
一个成人身体大约由 1014 个细胞组成。人体每天都有数亿个细胞衰老、死
亡,同时又有数亿个细胞增殖生长,在增殖生长过程中,难免出现几个异常细
胞,这种异常细胞受到某种致癌因素作用,可能发生变异,形成癌细胞。癌细
胞是产生癌症的根源。癌细胞可无限增殖、转化,且易转移,会破坏正常的细
胞组织,破坏器官的功能,逐渐形成癌症,也被称为恶性肿瘤,严重威胁人类
的健康和生命。癌症的发生是一个多因子、多步骤的复杂过程,病毒、霉菌、
射线、化学致癌剂等都是异常细胞转变成癌细胞的可能因素。癌症的形成分为
致癌、促癌、演进等几个过程,与吸烟、饮酒、环境、不健康饮食、不运动和
致癌因子等密切相关。任何年龄的人都可能患癌症,只是随着人年龄增长愈易
患癌。目前,世界上人类已知的癌症种类有 100 多种,身体的任何部位均有可
能受到癌细胞的侵袭。世卫组织最新公布数据表明,全球每年有 880 万人死于
癌症,占全球每年死亡总人数近六分之一,死者大多数在中低收入国家。每年
有 1400 多万新发癌症病例,预计到 2030 年这一数字将增加到 2100 多万。因此,
攻克癌症已成为当前医学上重要的研究课题。
在医学上,对于肿瘤病人通常采用手术切除肿瘤,然后再进行“化疗”。
化疗是化学药物治疗的简称,是利用化学药物作用于细胞周期的间期,基本原
理是抑制癌细胞的增殖、浸润和转移,直至最终杀灭癌细胞,从而控制病人病
情恶化的一种治疗方式。它是一种全身性治疗手段,和手术、放疗一起,成为
当今癌症的三大治疗手段。由于化疗药物的选择性差,在杀灭癌细胞的同时也
会不可避免地损伤人体正常的细胞,出现“杀敌一千,自损八百”的后果,往往产
生严重的药物不良反应和较严重的全身性毒副作用。因此,在接受化疗药物的
时候,不仅希望能够达到最佳的抗肿瘤作用,还要注意预防和尽量减少化疗药
物的不良反应。
有效的早期诊断可在发病初期检出癌症,使治疗更有效、简单,并降低费
用。根据世卫组织新发布的癌症早期诊断指南,所有国家均可采取措施改善癌
症早期诊断工作。如果人体癌症能被及早发现,并对癌变部位实现及时、高效、
精准的诊断并给予治疗,能大大降低癌症患者的病痛和死亡发生率。
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分子影像技术是运用影像学手段显示组织水平、细胞和亚细胞水平的特定
分子,反映活体状态下分子水平变化,能够探查疾病过程中细胞和分子水平的
异常,在尚无解剖改变的疾病前检出异常,为探索疾病的发生、发展和转归,
评价药物的疗效中,起到重要作用。另外,分子影像技术对人体组织无伤害性
侵入、对组织具有极强的穿透性,同时对人体组织分辨率较高,因此已成为当
今临床上最常用的诊断学成像技术之一。
计算机断层扫描(CT)是利用精确准直的 X 线束、γ 射线、超声波等,与灵敏
度极高的探测器一同围绕人体的某一部位作一个接一个的断面扫描,具有扫描
时间快,分辨率高等特点,能够快速准确地反映人体内异常部位的病变,可用
于多种疾病的早期诊断,并且对人体无侵入性,目前在临床诊断中已广泛使用
多年。CT 成像基本原理是用 X 线束对人体检查部位一定厚度的层面进行扫描,
由探测器接收透过该层面的 X 线,转变为可见光后,由光电转换器转变为电信
号,再经模拟/数字转换器转为数字信号,输入计算机处理。在 CT 成像中物体
对 X 线的吸收起主要作用,在一均匀物体中,X 线的衰减服从指数规律。在 X
线穿透人体器官或组织时,由于人体器官或组织是由多种物质成分和不同的密
度构成的,所以各点对 X 线的吸收系数不同,表现为 X 线的衰减程度差异。由
于能形象的呈现身体内部结构,CT 成像成为诊断疾病、治疗预测和疗效评估的
常规检查手段。[1]尽管有人担心 X-射线的辐射, CT 成像仍然在病情诊断中继
续扮演重要的角色。[2]根据一项新的 IMV 医疗信息部门的调查显示,在美国 CT
扫描的数量已由 2007 年的 68 700 000 例增加到 2010 年 81 900 000 例。与 PET
相比,CT 能以高分辨率提供 3D 的组织细节,灵巧地使感兴趣之外结构区域的
叠加消除,使成像效果显著改善。[1]通常核磁共振成像需要几分钟时间,而 CT
成像能达到很高的时间分辨率,甚至能快速捕捉到心脏的跳动。[3,4]这是因为 CT
原理是依靠组织上的 X-射线衰减,它能提供高电子密度材料的图片。然而,尽
管 CT 成像比传统放射线照相术有高很多的分辨率,但它仍然很难清晰的辨认软
组织的细微变化,因为大多数的软组织在 0~50 HU 之间有非常相似的 CT 值。
因此,为了能更好的描述我们所感兴趣部位的细微变化,我们就需要借助外源
的 CT 造影剂。根据 IMV 调查显示,2010 年, 55%的 CT 扫描需要使用 CT 造
影剂。采用造影剂后,增强扫描能够比常规 CT 扫描更清楚的显现出病变部位,
包括其边缘。在提高造影剂的成像性能和降低副作用方面,临床学者和造影剂
开发商经过数十年的不断探索,发现碘具有较高的原子数量,碘造影剂在临床
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CT 造影中广泛应用。[5]碘造影剂具有相当长的历史,可追溯到 20 世纪 20 年代。
第一个 X-射线碘造影剂是碘化钠,但是它的毒性限制了它的进一步应用。碘与
苯环连接结构比较稳定,吸收 X 线性能较强,苯环结构又提供了许多结合位点,
因此三碘苯环成为现代X线CT造影剂的基本结构。当今大多数碘造影剂为1,3,5-
碘基苯的衍生物。在碘化芳烃上引入羧基和氨基官能团能增加其生物相容性和
水溶性。第一代 X-射线碘造影剂,包括泛影酸盐,是由三碘苯单体和苯甲酸离
子组成。由于 CT 成像需要注射大量的造影剂,因此,离子造影剂介质的高渗透
压不得不受到格外关注。为解决这一问题,非离子水溶性碘造影剂日渐发展起
来。这种造影剂具有较低的渗透压,降低了不良反应发生的风险。还可以通过
增加每摩尔分子所含碘原子的数量,进一步降低造影剂的渗透压。通过共价键
将两个碘化芳烃连接成的二聚体,与血液有几乎相等的渗透压,且表现出很好
的耐受度。然而,由于这些 CT 造影剂均为含碘小分子,主要经过肾脏快速排泄,
仅允许很短暂的造影时间,且选择性较差,若大剂量使用又会导致严重不良反
应及部分患者过敏的问题。另外,这些造影剂在血管内和血管外的特别分布,
导致 CT 成像不清楚。而且,尽管碘造影剂通常是安全的,但由于其较高的渗透
压和粘性,有时会发生严重的不良反应。[6,7,8]为解决这些限制,纳米级的碘造影
剂,如胶束、聚合体和脂质体,已开始逐渐发展起来。[9]
在过去的几十年中,纳米技术已经得到了巨大的发展,[10,11,12,13]各种各样的
纳米材料,如胶束、聚合体和脂质体等,已被引入生物医学应用中。[14]有趣的
是,这些纳米材料随着体积不同或配位分子不同,其药代动力学,生物分布和
毒性也不同。[15]纳米粒子有更长的循环时间,还可以设计为靶向组织的输送载
体。[16,17,18]另外,纳米粒子表面适当修饰可以制备各种多功能的材料,比如多通
道成像,或同时具有诊断和治疗功能。[19]基于上述原因,粒径在纳米级的 CT 造
影剂具有巨大的发展潜力,[20]并且已开始逐渐发展起来。
理想的靶向 CT 造影剂载体一般需要具备以下几个特点:(1)有效地规避网
状内皮系统等的吞噬及破坏;(2)在人体内环境中,特别是靶细胞外生理环境
中稳定好,药物泄漏率少;(3)有效地在靶组织和靶细胞聚集,并能携带药物
进入靶细胞;(4)在靶细胞内实现可控释药。由于这些限制,纳米级碘 CT 造影
剂逐渐发展起来。为了获得细胞学和分子进程的信息,通常采用 CT 造影,就需
要使用 CT 造影剂。尽管药物可以通过 EPR 效应被动靶向到肿瘤组织,但主动
靶向能更高效的将药物递送到肿瘤组织和细胞。[21]胶束是指一种胶体分散状态,
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它是当水溶液中两性表面活性剂达到临界胶束浓度(CMC)以上时自然形成的。
[22]胶束的大小通常在 10 到 200 nm 不等,且适当的稳定胶束存在能延长体内循
环时间。胶束的核心由表面活性剂的疏水端组成,如此可以溶解多种水不溶性
化合物,包括一些药物、纳米粒子和造影剂,诸如紫杉醇、阿霉素以及碘油,
同时促进了 CT 成像和药物转运。聚合物 CT 造影剂是由碘化苯甲酸和氨基或羟
基基团聚合物反应制备的。[23,24]随着表面活性剂的扩散和分解,包埋在胶束内部
的小分子会泄露,[22]苯甲酸与聚合物之间强大的共价键阻止了含碘部分的损失。
另外,纳米粒子聚合物的一些官能团促进了多功能造影剂的发展。在各种聚合
物中,两性物质 AB 型共聚物由 PEG 长链和疏水基团组成,由于它的低 CMC
值、高稳定性和粒径小等优点很有吸引力。[25]空心聚合物可将各种小分子 CT 造
影剂制成胶囊包裹其中。[26,27,28]与胶束不同的是,胶束是利用亲脂性造影剂疏水
的相互作用,而将聚合物封装入胶囊不仅可用于疏水造影剂,还可用于亲水造
影剂。
金纳米粒子(AuNP)因其独特的性质和高生物相容性,已经收受到广泛地
研究,用于生物医学应用领域。[29]迄今,已经制备出各种各样的金纳米结构,
包括金球、金棒、金壳以及金笼等等。[30]因 AuNP 的光学特性,通过调整它的
形状或聚集状态,可用于生物诊断试剂,光热治疗,表面增强拉曼光谱(SERS),
光声成像(PAT),和可控释药等等。[31]此外,AuNP 因其表面易于修饰,使其
能够实现较好的生物相容性和靶向性。例如,其可对硫醇表现出很高的亲和力,
因而可以修饰各种配体(如 PEG 和寡核苷酸)。[32]金是一种非常惰性的材料,
适当稳定的 AuNP 具有很高的生物相容性。之前有研究显示,当 AuNP 浓度达
到 3.2g Au/kg 时,才会有很高的半数致死量 LD50。[33]当需要高剂量 CT 造影剂
时,AuNP 这种高的生物相容性表现出很大的优势。
由于其较高的原子序数(Z=79)和 k 阶能(80.7 keV),AuNP 通常比碘造
影剂具有更高的对比度。在更高的 X-射线管电压下,金与碘对 X-射线的衰减表
现出更大的差异。[34,35]例如,在 80 kVp 下,金纳米粒子的声噪比只比碘普罗胺
的声噪比高 14%,而在 140 kVp 时,两者差值可达到 115%。[34]当 X-射线穿过
病人身体时,射线的平均能量会增加,因为低能量的射线会被身体吸收或散射。
因此,碘的造影效果取决于它所处的环境,碘对于低能量的 X-射线敏感。碘在
水中或在含磷酸钙的水溶液中对 X-射线的衰减明显低于碘在空气中对 X-射线的
衰减。相比之下,无论是在水中或是在磷酸钙水溶液中,金纳米粒子对 X-射线
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的衰减并未明显减少。[35]以上结果表明,金纳米粒子具备 CT 造影剂的很大潜力,
因为 CT 造影通常选用高能 X-射线。
平均粒径约为 1.9 nm 的 AuNP,是最初被研究作为 X-线造影剂的。[33]因为
其粒径小,可以经过肾脏排泄。尽管 AuNP 与传统碘造影剂的排泄路径相似,
但是它们的清除率更低,可以在体内停留更长的成像时间。静脉注射 AuNP 后,
在体内X射线成像能详细的揭露组织结构,比如肿瘤和直径小于 100 μm的血管。
之后,各种各样的 AuNP 被研究用于 CT 造影剂。在制造 AuNP 的各种方法中,
在水溶溶液中用还原剂将 HAuCl4 还原(被称之为 Turkevich 法)是目前应用最
广泛的方法之一。[36]通过调节 HAuCl4 和还原剂的比率,可将纳米粒子的直径控
制在 3~100 nm。在一定的浓度下,纳米粒子越大,表现出的 CT 造影效果越强。
我们之前的研究[37]和 Peng 等人的研究[38]结果均表明,当金与碘这两种高度
不透 X 光的元素结合在一起时,二者具有协同作用,显示出显著增强的 X 线衰
减效应。
本研究旨在制备多功能含碘纳米粒子,同时作为 X 线 CT 造影剂和抗肿瘤
药物输送,实现对肿瘤细胞的高灵敏度诊断和治疗。本研究欲采用蒸馏沉淀法,
制得聚合物纳米粒子,并连接肿瘤靶向分子 FA,随后在聚合物纳米粒子中原位
沉积 AuNP,制得金掺杂的含碘纳米粒子复合物,作为 CT 造影剂和肿瘤药物
载体。并对所制得纳米体系进行一系列的结构和性能表征,考察该材料的物理
稳定性、载释药能力、细胞毒性、细胞摄取以及体外 CT 成像性能等。预期产
生 I 和 Au 的协同造影效果,同时完成抗肿瘤药物的传递,从而实现肿瘤的诊
疗一体化。
研究目的、方法
CT 扫描是利用精确准直的 X 线束、γ射线、超声波等,与灵敏度极高的探
测器一同围绕人体的某一部位作一个接一个的断面扫描,目前广泛应用于临床
疾病的诊断,具有扫描时间短,图像清晰等特点,在临床已经使用大半个世纪。
但由于其成像原理的限制,很难分辨软组织的微小变化。为增强软组织的对比
度,各种 CT 造影剂应运而生。在提高造影剂的成像性能和降低副作用方面,临
床学者和造影剂开发商经过数十年的探索研究,发现碘与苯环连接结构比较稳
定,吸收 X 线性能较强,苯环结构又提供了许多结合位点,因此三碘苯环成为
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现代 X 线 CT 造影剂的基本结构,如碘海醇、碘帕醇、碘普罗胺、泛影葡安等,
均为三碘苯环的衍生物,是目前临床上广泛使用的水溶性造影剂。然而,由于
这些三碘苯环结构 CT 造影剂均为含碘小分子,容易被快速清除,在体内循环时
间短,且选择性差,大剂量使用又会导致严重不良反应及部分患者过敏的问题,
因而极大的限制了它们在一些部位如肿瘤、肝、淋巴结等部位的靶向成像和血
管造影。[39]过去十几年中,研究者利用纳米粒子的可体内长循环、实体瘤组织
的高通透性和滞留效应(EPR 效应)、容易进行表面修饰及整合多功能于一体等
独特的性能来解决这一问题。大量研究集中于将临床应用的碘代小分子发展成
碘代纳米粒子,包括乳液[40,41]、脂质体[42-45]、脂质蛋白[46,47]、聚合物纳米粒子[48-52]
和不溶性纳米材料[53]等,其中许多已成功应用于体内。这些纳米材料的主要目
的是增加碘的浓度和达到一定粒径,使其对比度能高于常规水溶性 CT 造影剂,
并达到与临床所用碘代小分子造影剂不一样的体内动力学效果。除碘之外,研
究人员正在研究将其他金属元素的纳米材料(如 Au、Dy、Bi、Yb 等)引入碘
造影剂,这些金属材料往往具备较高的原子系数和 X-射线下较大的衰减系数,
[54]比碘更强的造影性能。如受到广泛关注的金元素能对 X 线衰减贡献较大的光
电效应,许多基于 Au 纳米粒子的造影剂用于体内 X 线 CT 成像。[55-57]我们之前
的研究[37]和 Peng 等人的研究[38]结果均表明,当金与碘这两种高度不透 X 光的元
素结合在一起时,二者具有协同作用,显示出显著增强的 X 线衰减效应。
将纳米粒子靶向到肿瘤组织或细胞,包括被动靶向和主动靶向。一方面通
过被动靶向主要利用 EPR 效应,主要包括脂质体、乳剂、纳米囊或纳米球、微
囊或微球等;一方面通过主动靶向,包括配体-受体结合靶向、抗体-抗原结合靶
向、热敏感靶向、pH 敏感靶向等。其中受体介导的靶向传递是采用物理或化学
的方法将特定的配体引入载体系统,通过配体与肿瘤细胞表面的受体发生特异
性相互作用,介导细胞对修饰有配体的载体材料实现高效内吞,从而达到主动
靶向传递的目的。叶酸受体是一种糖基磷脂酰肌醇偶联蛋白。除个别组织外,
叶酸受体在正常组织上表达水平很低,而在许多肿瘤细胞表面过表达,研究表
明,FA 是 FA 受体的高亲和配体(Kd ≈ 10-10 mol·L-1),[58]基于这种特性,叶
酸(FA)被广泛引用于肿瘤靶向分子。与其在正常组织中的表达水平相比,FA
受体在大肠癌、卵巢癌和乳腺癌等上皮恶性肿瘤中过表达。[59-61]FA 修饰的载体
可以通过受体介导的内吞作用被 FA 受体高表达的细胞高效摄取。[62]因此,研究
认为将 FA 修饰在大小合适的纳米粒子表面,制备肿瘤靶向纳米输送体系是一个
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不错之选。
本研究利用沉淀聚合法制备了大小均一、稳定性高的含碘聚合物纳米粒子
(P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP)。具体制备方法如示意图 1 所示,首
先将 3-氨基-2, 4, 6-三碘苯甲酸进行甲基丙烯酰化,得到可用于聚合的单体化合
物 2-甲基丙烯酰(3-酰胺-2, 4, 6-三碘苯甲酸)(MATIB)。再以该纳米粒子为单
体,以 N,N’-亚甲基双丙烯酰胺(MBA)为交联剂,再与甲基丙烯酸缩水甘油酯
(GMA)通过沉淀聚合方法进行共聚反应,得到具有交联结构和表面有环氧基
团修饰的含碘聚合物纳米粒子 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)。然后通过乙二胺
(EDA)在纳米粒子表面引入氨基,并进一步通过 EDC 缩合反应将叶酸(FA)
分子修饰在纳米粒子表面,得到 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA 纳米粒子。最
后,通过氯金酸还原法在纳米粒子上原位沉积金纳米粒子(AuNP),成功制得
含碘聚合物纳米粒子(P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP)。
Fig. 1 Schematic illustration for preparation of
P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP nanoparticles
图 1 制备聚合物纳米粒子 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 的示意图
之后,本研究对各步所得纳米粒子产物进行了全方位的表征。首先采用透
射电镜 TEM 观察其表面形貌、粒径及粒径分布,进而优化反应条件,制备出研
究各步所需的高质量聚合物纳米粒子。然后采用傅里叶红外光谱仪 FT-IR 和紫外
-可见光光谱仪 UV 表征其结构,考察叶酸 FA 是否被成功修饰到聚合物纳米粒子
表面。并采用元素分析法考察其 N 含量和碘 I 含量,计算出 FA 的负载量。采用
激光粒度分析仪表征其在水溶液中的粒径和粒径分布及 Zeta 电位。
将所制得的药物载体负载抗肿瘤药物 DOX 后,通过紫外-可见吸收光谱仪
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UV 检测该聚合物纳米粒子对 DOX 的载药量和包封率随 DOX 溶液初始浓度变
化的曲线,并对其它各步所得聚合物纳米粒子的载药量和包封率分别进行对比
研究,深入考察该聚合物纳米粒子的载药能力和机制。根据载药性能研究的结
果,选择合适的载药纳米粒子浓度,分别在不同 pH 值的缓冲溶液(50 mM,pH
6 或 7.4)中,对其进行进一步的体外释药试验。通过紫外-可见吸收光谱仪检测
载 DOX 聚合物纳米粒子的累积释药量随时间变化的曲线,考察其体外释药能力,
并探讨其智能释药机制。
通过细胞实验考察聚合物纳米粒子 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP、
负载 DOX 的聚合物纳米粒子 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 和游离
DOX 的细胞毒性,分别评估该聚合物纳米粒子在高浓度下的细胞毒性和其负载
DOX 后对靶细胞的杀伤能力。采用激光共聚焦荧光显微镜和流式细胞分析仪检
测负载 DOX 的聚合物纳米粒子 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 处理组
MCF-7 细 胞 内 DOX 的 荧 光 强 度 , 以 负 载 DOX 的 聚 合 物 纳 米 粒 子
P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-AuNP 处理组作为对照,考察所制得聚合物纳米粒
子的体外药物传递能力和肿瘤细胞靶向性,探讨其靶向作用机制。
TEM 结果显示所制得聚合物纳米粒子分散均匀,平均粒径为 135 nm。体外
X 线 CT 成像检测结果表明 AuNP 的掺杂显著增加了该纳米粒子的 X 线衰减性
能。该纳米粒子同时可高效负载抗肿瘤药物(DOX),载药量约为 51.3%,并具
有 pH 敏感的可控释放性能。体外药物输送结果显示有 FA 修饰的纳米粒子能更
好的携载抗肿瘤药物进入肿瘤细胞。细胞毒性试验的结果显示该聚合物纳米粒
子 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 在浓度不高于 100 μg/mL 时未显示明
显毒性。负载 DOX 后,有叶酸 FA 修饰的纳米粒子对肿瘤细胞具有更强的杀伤
性能。该纳米粒子可同时作为肿瘤靶向性 X 线 CT 造影剂和抗肿瘤药物载体,
用于肿瘤诊断和治疗。
本 研 究 采 用 沉 淀 聚 合 法 成 功 制 备 了 含 碘 聚 合 物 纳 米 粒 子
P(MATIB-co-MBA-co-GMA),并 将 FA 分子修饰到该纳米粒子表面,然后在该纳
米 粒 子 表 面 原 位 沉 积 金 纳 米 粒 子 ( AuNP ), 最 终 得 到
(P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP)聚合物纳米粒子,作为肿瘤靶向性 X
线 CT 造影剂。同时以该纳米粒子为载体,以抗肿瘤药物盐酸阿霉素(DOX)为
药物模型,研究了该纳米粒子作为抗肿瘤药物输送载体的性能,以期获得能同
时实现肿瘤靶向性成像和药物递送的纳米粒子系统,实现肿瘤的诊治一体化。
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天津医科大学硕士学位论文
在当今肿瘤医疗中,化疗因其选择性差,副作用大等原因使得多数肿瘤患
者无法承受而被迫中断治疗。本课题旨在研制一种可以对乳腺癌实现靶向性诊
断和治疗的药物载体,设想该载体可以在有效实现造影作用的同时,还可高效
地将抗肿瘤药物 DOX 运载到靶向肿瘤部位,通过受体介导的内吞作用进入肿瘤
细胞内部,并能够在人体正常生理温度及肿瘤细胞内部的酸性环境中实现可控
制释药,实现精准杀伤肿瘤细胞,提高肿瘤杀伤力的同时大大降低对其他正常
组织和细胞的毒性,从而降低全身毒副作用。本课题对以上设想分别进行了认
真的考察和验证,结果发现该聚合物纳米粒子大小均一、质量可控,且具有靶
向 可 控 释 药 特 性 和 低 毒 特 性 。 由 此 可 见 , 含 碘 聚 合 物 纳 米 粒 子
P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 具有作为抗肿瘤药物输送体系的潜力和
优势。
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天津医科大学硕士学位论文 一、纳米粒子的制备及表征
一、纳米粒子的制备及表征
1.1 仪器与试剂
1.1.1 仪器
电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司,BS124S)
数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司,KQ-500DB)
高速台式冷冻离心机 ST16R(美国 Thermo 公司)
磁力搅拌器(巩义市予华仪器有限责任公司,85-1)
透射式电子显微镜(Hitachi,HT7700)(TEM)
傅立叶变换红外光谱仪(Bruker,Tensor 27)(FT-IR)
紫外-可见吸收光谱仪(JASCO,V-570)(UV-vis)
真空干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司,DZF-6050)
CT 扫描仪(PHILIP MX-16 SLICE)
核磁共振波谱仪(Bruker, 400MHZ Advance)
激光粒度仪(Malvern,Zetasizer Nano-ZS)
1.1.2 试剂
2-甲基丙烯酰(3-酰胺-2, 4, 6-三碘苯甲酸)(MATIB)(由本实验室自合成)
N,N’-亚甲基双丙烯酰胺(MBA)(纯度 98%,天津中信凯泰化工有限公司,使
用前用丙酮重结晶,真空干燥)
乙腈(CN)(分析纯,天津杰尔正化工贸易有限公司)
氯金酸(HAuCl4)(分析纯,天津市风船化学试剂科技有限公司)
偶氮二异丁腈(AIBN)(分析纯,上海阿拉丁试剂有限公司)
甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)(分析纯,上海阿拉丁试剂有限公司)
甲醇(分析纯,天津利安隆博华医药化学有限公司)
乙二胺(EDA)(优级纯,上海阿拉丁试剂有限公司)
叶酸(FA)(南京博全科技有限公司)
1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)(西格玛奥德里奇贸易有限
公司)
N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)(上海阿拉丁试剂有限公司)
阿霉素(DOX)(上海浩然生物技术有限公司)
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天津医科大学硕士学位论文 一、纳米粒子的制备及表征
1.2 实验方法
1.2.1 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP纳米粒子的制备
本研究利用沉淀聚合法制备粒径均一、稳定性高的含碘聚合物纳米粒子
(P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP),该纳米粒子首先以 MATIB 为单体,
以 MBA 为交联剂,AIBN 为引发剂,合成单体聚合物,再通过 GMA 向聚合物
表面引入环氧基团,并用 EDA 将其表面氨基化,之后将叶酸分子 FA 修饰到该
聚合物纳米粒子表面,其中以 EDC 和 NHS 作为 FA 活化剂,最后原位沉积 AuNP,
最终制得含碘聚合物纳米粒子(P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP)。
1.2.1.1 单体化合物 2-甲基丙烯酰(3-酰胺-2,4,6-三碘苯甲酸)(MATIB)的
合成
取 DMA(16 mL)溶液加入 50 mL 的双颈圆底烧瓶中,DMA 溶液需提前用
分子筛干燥,然后加入 3-氨基-2, 4, 6-三碘苯甲酸(4.0 g,7.78 mmol),超声使
其完全溶解。圆底烧瓶上面依次连接冷凝管、标口玻璃弯形干燥管,将圆底烧
瓶置于油浴中加热,冷凝管通水,维持反应体系在 25 ℃之下,使用 5 mL 的注
射器将甲基丙烯酰氯(2.5 mL)缓慢逐滴滴加到溶解有 3-氨基-2, 4, 6-三碘苯甲
酸的 DMA 的溶液中,边滴加边用磁力搅拌器搅拌,滴加完成后,将油浴升温,
使反应体系温度上升到 50 ℃,并维持体系温度 50 ℃继续反应 12 h,期间用磁
力搅拌。反应结束后,将上述反应液冷却至 25 ℃,然后缓慢滴入 80 mL 25 ℃
超纯水中,持续搅拌反应 5 h 后,将所得沉淀离心,并先后用超纯水、乙腈洗
涤三遍。所得固体产物置于真空干燥箱中干燥,温度设定为 50 ℃。干燥后使用
无水乙醇对产物进行重结晶,然后再次置于 50 ℃的真空干燥箱中干燥至恒重,
得到本实验所需单体产物 MATIB。产物 MATIB 采用核磁共振波谱氢谱进行结
构表征。
1.2.1.2 含碘聚合物纳米粒子 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)的制备
在 250 mL 的圆底烧瓶中,称取单体 MATIB(900 mg,1.54 mmol),加入
144 mL 乙腈,14.4 mL 乙醇,超声使其完全溶解,然后加入交联剂 MBA(150 mg,
0.97 mmol)和引发剂 AIBN(22 mg,0.13 mmol),超声使其完全溶解。将圆底
烧瓶置于 85 ℃油浴中加热,使反应体系在 30 min 内沸腾并有乙腈回流。圆底
烧瓶上端接球形冷凝管,油浴采用变压器控温,变压器电压约为 55 V,油浴可
在反应前提前预热。反应 65 min 时加入 GMA(110 mg,0.77 mmol),反 应 80 min
11
天津医科大学硕士学位论文 一、纳米粒子的制备及表征
时终止反应。反应结束后,体系快速降温,利于得到粒径均匀的产物,沉淀产
物离心(12000 rpm,20 min),用适量 CN 清洗 3 次,并用真空干燥箱干燥,直
至产物恒重时,即可得到 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)含碘聚合物纳米粒子。
1.2.1.3 FA修饰的含碘聚合物纳米粒子(P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA)的制备
向无水甲醇(6 mL)中加入纳米粒子 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)40 mg,
超声使其分散,加入 EDA(3 mL),室温条件下,避光电磁搅拌 2 d,离心得到
P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-EDA 纳米粒子,沉淀用适量无水甲醇洗 3 次,用真
空干燥箱中干燥,直至产物恒重。
将 FA(40 mg,0.23 mmol)在 DMSO(4 mL)中利用超声完全溶解分散,
并加入活化剂 EDC(35 mg,0.18 mmol)和 NHS(21 mg,0.18 mmol),混合均
匀 , 37 ℃ 下 搅 拌 60 min , 得 到 黄 色 透 明 液 体 , 将 前 一 步 得 到 的
P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-EDA 纳米粒子(40 mg)加入上述液体中,继续避
光搅拌 4 d,离心得到 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA 纳米粒子,先后用 DMSO
和水洗, UV 检测其上清液,直至游离 FA 分子的特征吸收接近为 0。离心沉淀
产 物 , 并 于 真 空 干 燥 箱 中 干 燥 至 , 直 至 产 物 恒 重 , 即 得 到
P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA 含碘聚合物纳米粒子。
1.2.1.4 金纳米粒子 AuNP 在含碘聚合物纳米粒子 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA
上的沉积
取 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA 聚合物纳米粒子 15 mg,溶于 10 mL 去
离子水中,另取 HAuCl4·2H2O(15 mg,0.04 mmol)溶于 5 mL 去离子水中,加
入该纳米粒子均匀水溶液中,磁力搅拌 24 h,反应体系全程在避光条件下进行。
然后将反应液离心(12000 rpm,20 min),沉淀产物用去离子水洗三遍,洗至上
清 液 无 色 , 固 体 产 物 为 浅 黄 色 , 这 说 明 HAuCl4 已 成 功 吸 附 在
P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA 聚合物纳米粒子上,然后将洗净的产物重新分散
于 20 mL 去离子水中,之后在快速搅拌下,迅速加入新鲜配制的 3.5 mL NaBH4
(200 mmol/L)的 NaOH(100 mmol/L)溶液,[63]当 NaBH4 加入后,溶液体系
由浅黄立即变为深红色,继续磁力搅拌 120 min,产物离心并用去离子水洗三遍,
在真空干燥箱中干燥至恒重,即得到 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 含
碘聚合物纳米粒子。
1.2.2 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP纳米粒子的表征
1.2.2.1 TEM表征
12
天津医科大学硕士学位论文 一、纳米粒子的制备及表征
分别取各步所得的产物纳米粒子,制得适宜浓度的均匀分散溶液,分别吸
取少量滴在碳膜铜网上,自然晾干,然后置于透射电镜 TEM 下观查,并摄片记
录。分别用 Nano measurer 软件测量 TEM 图片中各步所得纳米粒子(>100 个)
的直径。
1.2.2.2 FT-IR光谱检测
采用傅里叶-红外光谱(FT-IR)仪,分别检测各步所得聚合物纳米粒子的红
外特征光谱图。首先将样品真空干燥,以 1:50 的比例,在研钵中与分别溴化
钾(KBr)研磨,混和匀均,并压制 KBr 窗片,充分干燥后,用傅里叶-红外光
谱(FT-IR)仪扫描样品,以纯溴化钾窗片作空白对照,减去 CO2 的吸收值和
H2O 的吸收值,得出所测纳米粒子的红外吸收光谱图。根据吸收光谱曲线和官
能团特征吸收峰,分析所得纳米粒子的特征结构。
1.2.2.3 UV-vis光谱检测
利用紫外-可见吸收光谱仪(UV-vis),以 FA 分子的紫外吸收曲线作参照,
检测叶酸 FA 修饰前的 P(MATIB-co-MBA-co-GMA) 聚合物纳米粒子和 FA 修饰
后的 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA 聚合物纳米粒子的 UV-vis 吸收光谱图。分
别将样品以适当的浓度,均匀分散于适量去离子水中,加入比色池,对样品进
行扫描,以去离子水作为空白对照,扣除去离子水的吸收,即可得到样品的UV-vis
吸收曲线。
1.2.2.4 检测水力直径和 Zeta电位
将 聚 合 物 纳 米 粒 子 P(MATIB-co-MBA-co-GMA) 、
P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-EDA 和 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-EDA-FA 分别
均匀分散于适量去离子水中,采用激光粒度仪统计各纳米粒子的 Zeta 电位、粒
径和粒径分布情况。
1.2.2.5 Au、I含量测定和 CT检测
分 别 取 纳 米 粒 子 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-EDA-FA 和
P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-EDA-FA-AuNP 适量,去离子水稀释至一定浓度,
分别测定其碘(I)含量、金(Au)含量。
1.2.3 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP纳米粒子的 CT造影性能考查
对 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 聚合物纳米粒子溶液的体外 CT 造
影性能进行检测,即测定该纳米粒子溶液的体外 CT 值。首先采用电感耦合等离
子 体 质 谱 分 别 测 定 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 和
13
天津医科大学硕士学位论文 一、纳米粒子的制备及表征
P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA 纳米粒子中的碘含量和金含量,然后按照碘浓
度,将纳米粒子分别配制成一系列不同浓度的水溶液,然后进行 CT 成像断层扫
描,所选用的 CT 仪型号为飞利浦 MX-16SLICE 型,为减少误差,分别在各溶
液中任意三个不同位置处读取 CT 值,同时选用医用碘海醇溶液的 CT 值作参照。
所选 CT 成像断层扫描参数:电压 90 kV;电流 34 mAs;层厚 1.5 mm;间距 0.75
mm。根据所得 CT 值,建立 CT 值-碘浓度曲线,其中选用同一溶液中三次读数
的平均值作为曲线中的 CT 值。
1.3 结果
1.3.1 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP纳米粒子的表征
首先,采用核磁共振波谱氢谱对第一步所制备的单体化合物 MATIB 进行表
征,在氢谱图中 1.95 ppm 处出现 -CH3 的质子峰,5.92 ppm 和 5.56 ppm 处出现
=CH2 的质子峰,8.35 ppm 处出现 Ar-H 处的质子峰,9.93 ppm 为 Ar-COOH 中
的质子峰,13.95 ppm 为-NH-中的质子峰。[64]
1.3.1.1 TEM表征
由图 2 可知,各步所制备的纳米粒子均为表面光滑、粒径均匀的球形,并
具有较好的分散性。P(MATIB-co-MBA-co-GMA)纳米粒子平均粒径为 102 nm,
当 表 面 修 饰 了 FA 分 子 并 沉 积 了 AuNP 后 , 所 得 的
P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 纳米粒子,平均粒径为 135 nm,并且在
其上可观察到均匀分布的粒径小于 5 nm 的 AuNP。
Fig. 2 TEM images of P(MATIB-co-MBA-co-GMA) (A) and
14
天津医科大学硕士学位论文 一、纳米粒子的制备及表征
P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP (B) nanoparticles
图 2 聚合物纳米粒子 P(MATIB-co-MBA-co-GMA) (A) and
P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP (B)的透射电镜图片
1.3.1.2 FT-IR光谱
P(MATIB-co-MBA-co-GMA) 纳 米 粒 子 和
P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 纳米粒子的 FT-IR 光谱如图 3 所示。在
P(MATIB-co-MBA-co-GMA)纳米粒子的 FT-IR 光谱中可以看到 1657 cm-1 和 1517
cm-1 处分别出现了属于酰胺基团中的 C=O 伸缩振动峰和 N-H 的弯曲振动峰,即
酰胺 I 带和酰胺 II 带,在 1731 cm-1 处出现了属于羧基的 C=O 伸缩振动峰。当与
FA 分子连接并沉积了 AuNP 后,所得的 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP
纳米粒子中原先属于羧基的 C=O 伸缩振动峰消失,并且属于酰胺基团的酰胺 I
带和 II 带谱峰的位置均发生了位移,说明 FA 分子通过酰胺键成功修饰到纳米粒
子表面。
Fig. 3 FT-IR spectra of P(MATIB-co-MBA-co-GMA) nanoparticles,
P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP nanoparticles and FA
图 3 聚合物纳米粒子 P(MATIB-co-MBA-co-GMA),
15
天津医科大学硕士学位论文 一、纳米粒子的制备及表征
P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 和叶酸 FA 分子的 FT-IR 光谱图
1.3.1.3 UV光谱图
P(MATIB-co-MBA-co-GMA)纳米粒子的 UV-vis 吸收光谱如图 4 所示。图中
可以看到,在 250 nm 处出现了属于纳米粒子中苯环共轭体系的特征吸收峰,在
修饰 FA 分子后,在 304 nm 处出现了 FA 分子相对应的吸收峰,相比游离 FA 分
子在 280 nm 处的吸收峰红移了 24 nm。在 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP
纳米粒子的 UV-vis 吸收光谱中位于 500 nm 左右的属于 AuNP 的吸收峰极其微
弱,可能由于相比苯环的特征吸收峰较弱所致。而属于纳米粒子中苯环共轭体
系的特征吸收峰出现在 226 nm 处,发生了 24 nm 的蓝移,可能 AuNP 的沉积导
致其与苯环共轭体系发生了一定程度的电子转移。
Fig.4 UV-vis absorbance spectra of P(MATIB-co-MBA-co-GMA) nanoparticles,
P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA nanoparticles,
P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP nanoparticles and FA
图 4 聚合物纳米粒子 P(MATIB-co-MBA-co-GMA),
P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA, P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 和 FA
的 UV-vis 光谱图
1.3.1.4 Zeta电位与粒径分析
16
天津医科大学硕士学位论文 一、纳米粒子的制备及表征
如表 1 所示,用激光粒度分析仪,测得各步所得纳米粒子的水力直径(Dh)
均小于 200 nm,且稍大于 TEM 照片中所得相应纳米粒子的平均粒径(Dn),分
析原因,可能是由于在水溶液中,各纳米粒子会有一定程度的溶胀所致。同时,
在水溶液中,各步所得纳米粒子的粒径分布表现均较窄,PDI 值由 0.002 到 0.077
之间不等,说明所制备的 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 纳米粒子粒径
非常均匀,且在水溶液中具有良好的分散性。从 Zeta 电位的表征结果可以看出,
P(MATIB-co-MBA-co-GMA) 纳米粒子的 Zeta 电位为-51.3±2.1 mV,这是由于其
表面连有大量羧基和环氧基所致。当与 EDA 连接后,表面大部分变成了氨基,
因而 Zeta 电位变为-16.2±0.4 mV,明显正向移动,说明 EDA 被成功连接到纳米
粒子 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)表面。在修饰了 FA 分子后,其又变为-49.3±1.4
mV,这是由于 FA 分子有两个羧基,通常以 γ 羧基与载体材料相连,而保留游
离 α 羧基,所以 Zeta 电位又负向移动。
Table 1 The size, size distribution, Zeta-potentials and content of I and Au in
nanoparticles from every step
表 1 各步所得纳米粒子的粒径、粒径分布、Zeta 电位和各步纳米粒子中的 I、
Au 含量
Nanoparticles Dn
(nm) Dh
PDI
(nm) Zeta
potential
(mV) Content
of I (%) Conten
t of Au
(%)
P(MATIB-co-MBA-co-GMA)
nanoparticles 102 134 0.002 -51.3±2.1 -- --
P(MATIB-co-MBA-co-GMA)
-EDA nanoparticles -- 136 0.015 -16.2±0.4 -- --
P(MATIB-co-MBA-co-GMA)
-FA nanoparticles
P(MATIB-co-MBA-co-GMA)
-FA-AuNP nanoparticles 123 143 0.044 -49.3±1.4 47.9 --
135 154 0.077 -- 31.9 12.6
1.3.2 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP纳米粒子的体外 X线衰减性能
通过 ICP-MS 检测得到 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA 纳米粒子中的碘 I
含量约为 47.9%,P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 纳米粒子中的碘 I 含量
约为 31.9%,金 Au 含量为 12.6%(见表 1)。以不同的碘 I 浓度配制一系列两种
纳米粒子的溶液,然后进行 CT 成像,读取相应的 CT 值,得到随碘 I 浓度变化,
这两种纳米粒子溶液的体外 X-射线衰减关系图,如图 4 所示。可以看出,随碘
17
天津医科大学硕士学位论文 一、纳米粒子的制备及表征
I 浓度增大,X-线的衰减能力逐渐增强,沉积了 AuNP 的纳米粒子其 CT 值明显
高于相同碘 I 含量下的 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA 纳米粒子溶液的 CT 值,
说明 AuNP 的掺入显著增强了其 CT 造影性能。
Fig.4 Relationship of X-ray attenuation with I concentration in
P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA nanoparticles and
P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP nanoparticles in vitro.
图 4 聚合物纳米粒子 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA 和
P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 随碘浓度增加体外 X-射线衰减关系图
1.4 讨论
1.4.1 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP纳米粒子的制备和表征
1.4.1.1 TEM检测
由图 2 可知,各步反应所制备的产物均为粒径均匀、表面平滑的纳米球,
且随各步反应增加,纳米球的粒径随之逐渐增大,同时可见各步所得纳米球均
表现出较窄的粒径分布,其分散系数(PDI)均远远小于 1.0(见表 1),可以看
出,在合成和修饰过程中,该聚合物纳米粒子能保持均匀分散。通过第一步的
沉淀聚合反应合成得到的 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)纳米粒子平均粒径为 102
nm , 当 表 面 修 饰 了 FA 分 子 并 沉 积 了 AuNP 后 , 所 得 的
P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 纳米粒子,平均粒径为 135 nm,并且在
其上可观察到均匀分布的粒径小于 5 nm 的 AuNP。
本实验室之前的研究表明,沉淀聚合反应中聚合物微粒的形成受溶剂系统
性质影响显著。[65]本研究选择乙腈作为弱极性化合物的沉淀聚合反应的主要溶
18
天津医科大学硕士学位论文 一、纳米粒子的制备及表征
剂。首先,以 DMA 为溶剂,将甲基丙烯酰氯与 3-氨基-2, 4, 6-三碘苯甲酸在适
当的条件下合成得到本实验所需单体化合物 MATIB。
之后,以 MATIB 为单体,以 MBA 为交联剂,合成交联的聚合物纳米粒子
P(MATIB-co-MBA),此时为增加单体溶解度,采用乙腈-乙醇(10:1)混合溶剂。
聚合反应在油浴中进行,油浴温度应尽量控制在 80~85℃,反应开始前油浴需预
热,反应结束时应尽快将反应体系降温,使其尽快冷却,终止反应,从而使得
到的纳米粒子粒径更加均匀。为了能使肿瘤靶向分子 FA 能成功连接在
P(MATIB-co-MBA)纳米复合物表面,首先要在纳米复合物表面引入活性环氧基
团,可在沉淀聚合反应的后期,加入功能化 GMA,进行共聚。然后,加入 EDA,
这些环氧基便可发生开环反应,与 EDA 连接,从而引入碱性基团氨基(-NH2)。
最后,这些碱性基团(-NH2)便可与 FA 中被活化的羧基(-COOH)发生酰胺化
反应,FA 便成功地被修饰到纳米聚合物表面。最后在该聚合物纳米粒子表面原
位沉积 AuNP,先将所制得的纳米粒子与 HAuCl4 充分混合搅拌,使 Au3+与聚合
物纳米粒子中的羰基、羧基等充分配位,然后将多余的 HAuCl4 除去,随后在剧
烈搅拌下加入还原剂。所沉积的 AuNP 的大小与还原剂 NaBH4 的量相关,同时
由于还原反应非常迅速,因而其大小也和搅拌速度相关。
1.4.1.2 FT-IR检测
采用 FT-IR 光谱仪,分别检测各步所得聚合物纳米粒子的红外特征光谱图。
首先,以 1:50 的比例,分别将样品与溴化钾(KBr)在研钵中研磨,混和均匀,
然后压 KBr 窗片,用 FT-IR 光谱仪扫描样品,样品要充分干燥,得出各步所得
的纳米复合物样品的 FT-IR 吸收光谱图,见图 3。在 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)
纳米粒子的 FT-IR 光谱中可以看到 1657 cm-1 和 1517 cm-1 处分别出现了属于酰胺
基团中的 C=O 伸缩振动峰和 N-H 的弯曲振动峰,即酰胺 I 带和酰胺 II 带,在 1731
cm-1 处出现了属于羧基的 C=O 伸缩振动峰。当与 FA 分子连接并沉积了 AuNP
后,所得的 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 纳米粒子中原先属于羧基的
C=O 伸缩振动峰消失,并且属于酰胺基团的酰胺 I 带和 II 带谱峰的位置均发生
了位移,说明 FA 分子通过酰胺键成功修饰到纳米粒子表面。
1.4.1.3 UV检测
采用 UV-vis 吸收光谱仪分别检测各步所得纳米粒子的 UV-vis 吸收光谱图。
在 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)纳米粒子的 UV-vis 吸收光谱中可以看到,在 250
nm 处出现了属于纳米粒子中苯环共轭体系的特征吸收峰,在修饰 FA 分子后,
19
天津医科大学硕士学位论文 一、纳米粒子的制备及表征
在 304 nm 处出现了 FA 分子相对应的吸收峰,相比游离 FA 分子在 280 nm 处的
吸收峰红移了 24 nm。在 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 纳米粒子的
UV-vis 吸收光谱中位于 500 nm 左右的属于 AuNP 的吸收峰极其微弱,可能由于
相比苯环的特征吸收峰较弱所致。而属于纳米粒子中苯环共轭体系的特征吸收
峰出现在 226 nm 处,发生了 24 nm 的蓝移,可能 AuNP 的沉积导致其与苯环共
轭体系发生了一定程度的电子转移。
1.4.1.4 粒径分析和 Zeta电位测试
如表 1 所示,各步所得纳米粒子用激光粒度分析仪测定的水力直径(Dh)
均小于 200 nm,且稍大于 TEM 照片中所得相应纳米粒子的平均粒径(Dn),这
可能是由于在水溶液中,纳米粒子存在一定程度的溶胀所致。同时,各步所得
纳米粒子在水溶液中,粒径分布均表现较均匀,PDI 值由 0.002 到 0.077 之间不
等,说明所制备的 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 纳米粒子粒径非常均
匀,且在水溶液中呈现很好的分散性。从 Zeta 电位的表征结果可以看出,
P(MATIB-co-MBA-co-GMA) 纳米粒子的 Zeta 电位为-51.3±2.1 mV,这是由于其
表面连有大量羧基和环氧基所致。当与 EDA 连接后,表面大部分变成了氨基,
因而 Zeta 电位变为-16.2±0.4 mV,明显正向移动,说明 EDA 被成功连接到纳米
粒子 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)表面。在修饰了 FA 分子后,其又变为-49.3±1.4
mV,这是由于 FA 分子有两个羧基,通常以 γ 羧基与载体材料相连,而保留游
离 α 羧基,所以 Zeta 电位又负向移动。
1.4.2 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP纳米粒子的体外 X线衰减性能
通过 ICP-MS 检测得到 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA 纳米粒子中的 I 含量
约为 47.9%,P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 纳米粒子中的 I 含量约为
31.9%,Au 含量为 12.6%(见表 1)。以不同的 I 浓度配制一系列两种纳米粒子的
溶液,然后进行 CT 成像,读取相应的 CT 值,以 I 浓度为横坐标,以相应的 CT
值为纵坐标,得到随着 I 浓度变化,这两种纳米粒子溶液的体外 X-射线衰减关
系图,如图 4 所示。可以看出,随 I 浓度增大,X-线的衰减能力逐渐增强,且沉
积了 AuNP 的 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 聚合物纳米粒子其 CT 值明
显高于相同 I 含量下的 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA 纳米粒子溶液的 CT 值,
说明 AuNP 的掺入显著增强了其 CT 造影性能。
20
天津医科大学硕士学位论文 一、纳米粒子的制备及表征
1.5 小结
本研究采用沉淀聚合法成功制备了 FA 修饰并沉积了 AuNP 的含碘聚合物
P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 纳米粒子。并通过 TEM、FT-IR 光谱、
UV-vis 光谱、激光粒度仪和 Zeta 电位等表征了该纳米粒子的表面形貌和结构。
TEM 图片表明,各步所制备的纳米粒子均为表面光滑的球形,并具有较窄的粒
径分布和较好的分散性。P(MATIB-co-MBA-co-GMA)纳米粒子平均粒径为 102
nm , 当 表 面 修 饰 了 FA 分 子 并 沉 积 了 AuNP 后 , 所 得 的
P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 纳米粒子,平均粒径为 135 nm,并且在
其上可观察到均匀分布的粒径小于 5 nm 的 AuNP。FT-IR 光谱和 UV 光谱,证明
了 FA 分子是通过酰胺键连接到纳米粒子 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)表面。Zeta
电位变化与各步纳米粒子粒径的逐步增大,表征了各步反应的存在和对纳米粒
子的影响。通过体外 X 线 CT 成像性能,表明了该纳米粒子具有良好的 X 线衰
减效应。
综上,含碘聚合物 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 纳米粒子制备简
单,易操控,同时产物具有良好的分散性和稳定性,具备作为 X 线 CT 造影剂
优势。
21
天津医科大学硕士学位论文 二、纳米粒子的载药及释药性能研究
二、纳米粒子的载药及释药性能研究
2.1 仪器与试剂
2.1.1 仪器
离心机(Eppendorf,centrifuge 5810R)
酸度计(上海精密科学仪器有限公司,PHS-25)
电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司,BS124S)
数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司,KQ-500DB)
透射电镜(Hitachi,HT7700)
紫外-可见吸收光谱仪(JASCO,V-570)
磁力搅拌器(巩义市予华仪器有限责任公司,85-1)
真空干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司,DZF-6050)
激光粒度分析仪(Nanoscope IV,Digital DelsaNano C,Beckman)
透析袋(MWCO=3500)(天津市联星生物技术有限公司)
2.1.2 试剂
阿霉素(DOX)(上海浩然生物技术有限公司)
磷酸二氢钠(NaH2PO4·H2O)(天津光复精细化工有限公司)
磷酸氢二钠(Na2HPO4)(天津光复精细化工有限公司)
2.2 实验方法
2.2.1 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP纳米粒子的载药性能研究
将 一 系 列不 同 初始浓 度 , 相同 体 积 的 DOX 溶 液 分 别 与 相 同 体 积 的
P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP(0.5 mg/mL)溶液均匀混合后,置于摇床
上温和振摇 24 h,温度 25 ℃,全过程在避光条件下进行。反应结束后,离心可
得负载 DOX 的纳米粒子,取上清液置于 UV-vis 吸收光谱仪检测其在 480 nm 处
的吸收,根据 DOX 浓度-吸收值曲线,计算得到上清溶液中 DOX 的浓度和余量。
负载在该聚合物纳米粒子上的 DOX 药量,等于初始溶液中 DOX 的总量减去负
载后离心上清溶液中的 DOX 的残余量,即得。按照公式(1)和(2)计算得到
该纳米粒子的载药量和包封率:
载药量 = (Wadministereddose-Wresidual dose in solution)/Wnanoparticles×100% (1)
22
天津医科大学硕士学位论文 二、纳米粒子的载药及释药性能研究
包封率= (Wadministereddose-Wresidual dose in solution)/Wadministereddose×100%(2)
其中,Wadministereddose 指初始溶液中 DOX 的总质量,Wresidual dose in solution 指负
载后上清溶液中 DOX 的残余量,Wnanoparticles 指用于载药的纳米粒子的质量。[66]
2.2.2 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP纳米粒子的体外释药性能研究
根据载药性能检测的结果,制备载药(DOX 溶液初始浓度为 0.414 mg/mL)
P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 纳米粒子(1.0 mg/mL),测定负载 DOX
后的 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 纳米粒子分别在不同 pH 值的 PBS
缓冲溶液(50 mM,pH 6.0 或 7.4)中 37 ℃下的体外释药性能。将负载 DOX 的
纳米粒子均匀分散于 8 mL 去离子水中,平均分为 2 等份,分别置于透析袋中,
透析袋的截留分子量为 3500,再将透析袋分别置于两组缓冲溶液中,两组缓冲
溶液分别为 pH 6.0,60 mL 和 pH 7.4,60 mL,缓冲溶液温度控制在 37℃,缓慢
搅拌缓冲溶液进行释药,每个 pH 条件平行做 3 组。分别在 0.5 h,1 h,1.5 h,2
h,4 h,6 h,8 h,24 h,30 h,48 h 几个时间点从两组释药容器内分别取出 1.5 mL
均匀缓冲溶液,测定其在 480 nm 处的紫外吸收,通过计算得到其中 DOX 的浓
度和量。为保持药物释放体系的体积不变,每次取样后向容器内补加相同条件
的新鲜的缓冲盐溶液 1.5 mL。48 h 后停止此次释药实验,以此时穿过透析膜释
放的药物分子 DOX 的总量表示累积释放药量。
2.3 结果
2.3.1 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP纳米粒子载药性能研究
如图 5 所示,在一定范围内,P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 纳米粒
子的载药量随着 DOX 溶液初始浓度的增加而不断增大,而包封率则随着 DOX
溶液初始浓度的增加而不断减小。当 DOX 溶液的初始浓度为 1.5 mg/mL 时,纳
米 粒 子 的 载 药 量 为 51.3% , 包 封 率 为 34.2% 。 此 时 纳 米 粒
P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 的载药量不再随初始 DOX 的量的增加而
增大,载药量达到饱和。
23
天津医科大学硕士学位论文 二、纳米粒子的载药及释药性能研究
Fig.5 The drug loading capacity and encapsulation efficiency of
P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP nanoparticles with different initial DOX
concentrations.
图 5 不同初始浓度 DOX 溶液下 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 纳米粒子
的载药量和包封率
2.3.2 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 纳米粒子体外释药性能研究
载药纳米粒子在不同 pH 下对 DOX 的释放曲线如图 6 所示,6 h 内两种 pH
下的释药速率均较快,之后 DOX 的释放速率变得缓慢,48 h 后,在 pH 6.0 的
PBS 溶液中 DOX 释放率约为 25%,明显高于在 pH 7.4 的缓冲溶液中的释放速
率,说明 DOX 在该纳米粒子中的释放在一定程度上受环境 pH 的影响。
24
天津医科大学硕士学位论文 二、纳米粒子的载药及释药性能研究
Fig.6 The Dox release from P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP nanoparticles
under different pH values.
图 6 载 DOX 的 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 纳米粒子在不同 pH 下的
药物释放曲线
2.4 讨论
2.4.1 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP纳米粒子载药性能研究
本研究选用目前常用的一种广谱抗肿瘤药 DOX 考察含碘聚合物纳米粒子
P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 的载药和释药性能。将一系列梯度初始浓
度的 DOX 溶液分别与等量的 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 纳米粒子溶
液混合均匀,置于摇床上温和地振摇 24 h,全程避光条件下进行,温度设定 25℃。
载药结束后,离心得到负载 DOX 的纳米粒子,并通过 UV-vis 吸收光谱仪测定
上清溶液在 480 nm 处的吸收值,根据 DOX 的吸收值-浓度标准曲线计算得到上
清溶液中 DOX 的浓度和残余量。用初始溶液中 DOX 的总加入量减去负载后上
清溶液中的 DOX 的残余量,即可计算得到负载在该聚合物纳米粒子上的药量。
结 果 如 图 5 所 示 , 在 一 定 DOX 浓 度 范 围 内 ,
P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 纳米粒子的载药量与 DOX 溶液的初始浓
度正相关,而包封率则与 DOX 溶液的初始浓度反相关。当 DOX 溶液的初始浓
25
天津医科大学硕士学位论文 二、纳米粒子的载药及释药性能研究
度增加到 1.5 mg/mL 时,该纳米粒子的载药量可达到 51.3%,相应包封率达到
34.2%。此时纳米粒子的载药量不再随初始 DOX 的量的增加而增大,载药量达
到饱和。
为了确保所测得的载药量尽可能地接近真实值,首先要使得未被装载的
DOX 处于完全溶解状态,尽量避免沉降,就要使所测得载药时 DOX 和聚合物
纳米粒子混合溶液处于弱酸性环境,pH 值<5。其次,水洗离心获得的载药聚合
物纳米粒子,用 UV-vis 光谱仪检测其上清溶液中 DOX 的吸收值接近于 0。这意
味着本研究中聚合物对 DOX 的高效包封是出现纳米粒子高载药量的重要因素,
排除了 DOX 沉淀析出和纳米粒子表面物理吸附等因素的影响。因此,出现这种
结果很有可能是因为 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 纳米粒子经 EDA 修
饰后,表面形成丰富的碱性基团(-NH2),与 DOX 分子中的强极性基团如羟基
(-COOH)形成较强的氢键作用的结果。
2.4.2 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP纳米粒子体外释药性能研究
根据载药性能检测结果,制备载药(DOX 溶液初始浓度为 0.414 mg/mL)
P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 纳米粒子(1.0 mg/mL)溶液,测定负载
DOX 后的 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 纳米粒子分别在不同 pH 值的
PBS 缓冲溶液(50 mM,pH 6.0 或 7.4)中 37 ℃下的体外释药性能。具体操作
方法为,将负载 DOX 纳米粒子均匀分散于 8 mL 去离子水中,平均分成 2 等份,
分别置于两个透析袋中,要求透析袋的截留分子量为 3500,然后将这两个透析
袋分别置于 pH 6.0(50 mM,60 mL)和 pH 7.4(50 mM,60 mL)两种缓冲溶
液中,温和地搅拌缓冲溶液进行载药粒子释药,为保证释药结果的准确性,以
上步骤需做 3 组平行对照实验,释药实验注意全程避光。在每一个预定的时间
点,分别从释药容器中吸取缓冲溶液 1.5 mL,并测定其在 480 nm 处的紫外吸收
值,根据 DOX 浓度-吸收曲线计算出缓冲溶液中 DOX 的浓度,从而计算出此时
纳米粒子中 DOX 的释放量。注意,在每次取样后,需分别向释药容器中补加 1.5
mL 相同条件的新鲜缓冲盐溶液,从而使 DOX 释放体系的体积环境维持不变。
当停止释药实验时,穿过透析袋的药物 DOX 分子的总量,即可视为 DOX 累积
释放药量。结果如图 6 所示,开始释药 6 h 内释药速率较快,之后 DOX 的释放
速率变得缓慢,48 h 后,在 pH 6.0 的 PBS 溶液中 DOX 释放率约为 25%,明显
高于在 pH 7.4 的缓冲溶液中的释放率,这可能是由于在不同 pH 条件下,聚合物
纳米粒子的与 DOX 的氢键作用强弱不同,或者与分子溶胀状态有关。说明 DOX
26
天津医科大学硕士学位论文 二、纳米粒子的载药及释药性能研究
在该纳米粒子中的释放具有一定的 pH 响应性,可以在偏酸性的肿瘤细胞中实现
更多药物释放,而在偏碱性的人体正常体液和细胞中释放较少,从而使毒副反
应的发生减少。
以上结果表明,P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 聚合物纳米粒子具有
显著的 pH 响应性药物释放特性,具备新型智能药物载体的潜力。
2.5 小结
聚合物纳米粒子 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 的载药性能研究发
现,在一定浓度范围内,该纳米聚合物的载药量与 DOX 溶液的初始浓度呈正相
关,而其对应的包封率则呈反相关。当载药量达到最大 51.3%时,其对应的包封
率 可 达 34.2% 。 体 外 释 药 性 能 研 究 表 明 , 负 载 DOX 的
P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 聚合物纳米粒子具有明显的 pH 响应性药
物释放特性,在 pH 6.0 的 PBS 缓冲溶液中 DOX 释放率约为 25%,明显高于在
pH 7.4 的缓冲溶液中的释放率。综上所述,P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP
聚合物纳米粒子具有较高的药物负载率和可控释药特性,这使其很有可能成为
新型智能药物载体的潜在优势。
27
天津医科大学硕士学位论文 三、纳米粒子的细胞毒性及细胞吸收性能研究
三、纳米粒子的细胞毒性及细胞吸收性能研究
3.1 仪器与试剂
3.1.1 仪器
纯水仪(MillipakOR40(Millipore))
高压灭菌锅(Hirayama)
SW-CJ-1FD 型单人单面净化台(ZHJH-C1112B,上海睿钰生物科技有限公司)
CO2 培 养 箱 (Forma Scientific)
低温冰箱(Haier 公司)
激光共聚焦荧光显微镜(Olympus,FV1000)
酶标仪(Promega,GloMax-Multi)
高速台式冷冻离心机 ST16R(美国 Thermo 公司)
流式细胞仪(BD FACSVerseTM)
Countstar 自动细胞计数仪(上海睿钰生物科技有限公司,IC 1000)
培 养 瓶 (Corning)
2.0 mL 冻 存 管 (Corning)
微 量 移 液 器 (Eppendorf)
96/24/6 孔 板 (Costar)
3.1.2 试剂
胎牛血清(FBS)(HyClone 公司)
4%多聚甲醛固定液(AR1068,Boster)
二 甲 基 亚 砜 ( DMSO)(Sigma-Aldrich)
青 /链 霉 素 (Gibco)
0.125% 胰蛋白酶-EDTA(1×)(生命科技公司)
完全培养液(DMEM)(HyClone 公司)
3.2 实验方法
3.2.1 MCF-7细胞的复苏、培养及冻存
3.2.1.1 细胞复苏
从液氮罐中取出冻存的人乳腺癌细胞 MCF-7,放入 37 ℃水浴中,使其在 l
28
天津医科大学硕士学位论文 三、纳米粒子的细胞毒性及细胞吸收性能研究
min 内解冻。在超净工作台内用 75% 酒精棉球擦拭冻存管外周,打开管盖,用
无菌吸管吸出细胞悬液,转至已加好基本培养基的无菌离心管中,1000 rpm,离
心 5 min,向离心管外喷洒适量 75%酒精后再拿回超净工作台,弃去上清,在细
胞沉淀中加入含有 10% FBS 和 1% 青/链霉素的 DMEM 完全培养液反复吹打,
用移液枪移入无菌培养瓶中,加入适量完全培养基,置于 5% CO2、37 ℃的培
养箱中培养,次日更换 DMEM 完全培养液。
3.2.1.2 细胞培养
MCF-7 细胞贴壁生长于含 10% FBS 和 1% 青/链霉素的 DMEM 培养液中,
置于 5% CO2、37 ℃的培养箱中培养,每 1-2 d 更换新鲜培养液。当细胞铺满培
养瓶底后,弃去旧培养液,加入 0.125% 胰酶,孵箱消化 1 min,加入适量培养
液中止消化,1000 rpm,离心 3 min,吸弃上清,再次加入适量培养液并吹打细
胞,按 1∶4 传代,置于孵箱中培养。期间随时观察细胞的状态和数量,待细胞
进入对数生长期后,用于实验。
3.2.1.3 细胞冻存
待细胞进入对数生长期时,弃去培养液,加入 0.125% 胰酶消化 1 min,1000
rpm,离心 3 min,吸弃上清,收集细胞,用含 10% DMSO 的完全培养基重悬并
调整细胞浓度为 5×106 个/mL,按每管 l mL 的体积分装入冻存管中并封口,做
好标记,放入冻存盒,置于-80 ℃冰箱中,12 h 后移至液氮中保存。
3.2.2 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP纳米粒子的细胞毒性研究
3.2.2.1 聚合物纳米粒子的细胞毒性检测
人乳腺癌细胞 MCF-7 培养于含 10% 胎牛血清 FBS 和 1% 青/链霉素的细胞
DMEM 培养液中,在 5% CO2、37 ℃的孵箱中培养,将处于对数生长期的 MCF-7
细胞接种于 96 孔无菌板中,按每孔细胞浓度约 5 000 个/孔,终体积为 100 μL/
孔,在培养箱中培养 24 h 后,将 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 纳米粒
子溶液分别按照 0,1,10,100,500,1000 μg/mL 的系列浓度加入其中,每个
浓度设置 3 个复孔,在 5% CO2、37 ℃的培养箱中培养 48 h 后取出,每孔加入
20 μL MTT 溶液,继续孵箱培养 4 h 后,小心吸弃孔内的培养基,每孔加入 DMSO
150 μL,避光条件下放在摇床上低速振荡 10 min,待结晶充分溶解后,置于酶标
仪上,以以空白孔作为凋零孔,以未加载体溶液的孔作为对照孔,测定每孔在
490 nm 波长处的吸光值,按公式(3)计算上述培养基中细胞的相对存活率:
W = (A-A0)/(A1-A0)×100% (3)
29
天津医科大学硕士学位论文 三、纳米粒子的细胞毒性及细胞吸收性能研究
其中,W 为相对细胞存活率,A 为实验孔吸光值,A0 为空白孔吸光值,A1
为对照孔吸光值。[66]
3.2.2.2 载 DOX聚合物纳米粒子和游离 DOX的细胞毒性比较
首先制备载 DOX 的 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 纳米粒子溶液。
根据 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 纳米粒子对 DOX 的最大负载量,向
纳米载体溶液中加入已知浓度的 DOX 溶液(纳米载体溶液需提前经加速器灭
菌),混合均匀,置于恒温摇床上振摇 24 h,全程避光温和,使 DOX 充分负载
于纳米载体之中。
按照 3.2.2.1 的方法,将处于对数生长期的 MCF-7 细胞接种于 96 孔板中,
每孔的细胞浓度约 5 000 个/孔,终体积为 100 μL/孔。在培养箱中培养 24 h 后,
每孔加入载 DOX 纳米粒子溶液,分别按 DOX 浓度为 0.01、0.05、0.1、0.5、1、
2.5、5 μg/mL 的浓度添加,并以相同系列浓度的游离 DOX 溶液处理组作为对照,
为提高实验结果准确性,每个浓度平行做 3 组。在孵箱中培养,5% CO2、37 ℃,
48 h 后取出,每孔加入 20 μL MTT 溶液,继续孵箱培养 4 h 后,小心吸弃孔内的
培养基,每孔加入 DMSO 150 μL,避光放在摇床上低速振荡 10 min,待结晶完
全溶解后,置于酶标仪上测定每孔在 490 nm 波长处的吸光值,测定和计算方法
同上。
3.2.3 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP纳米粒子的体外靶向性研究
采 用 激 光 共 聚 焦 荧 光 显 微 镜 观 察 负 载 DOX 的
P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 纳米粒子的入胞能力,以负载 DOX 的
P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-AuNP 纳米粒子作为对照。分别将终浓度为 1 μg/mL
的 负 载 DOX 的 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 纳 米 粒 子 和
P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-AuNP 纳米粒子与人乳腺癌 MCF-7 细胞 5% CO2、
37 ℃的培养箱中孵育 0.5 h 后,通过共聚焦荧光显微镜观察。进一步采用流式
细胞分析仪检测该纳米粒子的肿瘤细胞靶向性。
3.2.3.1 激光共聚焦荧光显微镜成像
首先制备爬片细胞,本实验使用的是专用爬片,是直径约为 22 mm 的圆形
载玻片,比 24 孔板孔径稍小些。将爬片在 75% 酒精中浸泡 4-6 h,后在超净台
中用 PBS 清洗 3-4 遍,直接置于 24 孔板中。然后将处于对数生长期的 MCF-7
细胞接种于 24 孔板之中,浓度约为 1.5×104 个/孔,细胞溶液体积 500 μL/孔,待
细胞爬片后长至 70% 左右即可进行细胞转染实验。
30
天津医科大学硕士学位论文 三、纳米粒子的细胞毒性及细胞吸收性能研究
分别取等量的 FA 修饰前的 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-AuNP 纳米粒子和
FA 修饰后的 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 纳米粒子(浓度均为 500
μg/mL,与等量的 DOX 溶液(初始浓度为 1500 μg/mL)混合,置于恒温摇床上,
避光摇晃 24 h。离心得到饱和载药纳米粒子,根据饱和载药量 51.3%,可以计算
得到纳米粒子上负载的 DOX 的量。
将上述离心得到的载药纳米粒子分别均匀分散于适量的 DMEM 基本培基
中,使其 DOX 浓度均为 1 μg/mL,并将其分别加入以上准备好的 24 孔板中,置
于培养箱中孵育 0.5 h 后,吸弃残液,PBS 洗 2 遍,每孔 500 μL,轻晃,之后每
孔加入 4% 多聚甲醛 400 μL,室温固定 10 min,PBS 摇洗 2 次之后(每孔 500 μL,
5 min/次,100 rpm),用 DAPI 200 μL 染核,室温下避光反应 9 min,PBS 洗 2
遍,10 min/次,将封片剂 20 μL 滴在载玻片上,捞片时用弯曲的 1 mL 注射器针
头轻轻挑起一角,用镊子夹取,占掉水,反扣(玻下有细胞的一面碰触封片剂),
轻轻放下,注意不要有气泡,放入暗盒过夜,在激光共聚焦荧光显微镜下观察。
3.2.3.2 流式细胞仪检测
首先从培养箱中取出处于对数生长期的 MCF-7 细胞,用提前预热的 0.125%
胰酶消化,分别接种于 24 孔板中,接种浓度约为 1.5×104 个/孔,每孔细胞溶
液体积为 500 μL,置于 5% CO2、37 ℃的孵箱中培养,待细胞生长至 70% 左右
进行细胞转染实验。取等量的 FA 修饰前的 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-AuNP
载 DOX 纳米粒子和 FA 修饰后的 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 载 DOX
纳米粒子,分别分散于适量的 DMEM 基本培基中,使其 DOX 浓度均为 0.5
μg/mL,并将其分别加入以上准备好的 24 孔板中,每孔药液 500 μL。以未经处
理的细胞作为空白对照组。置于培养箱中孵育 0.5 h 后,用预冷过的 PBS 将 24
孔板中的细胞轻轻洗涤 3 遍,将培养基及死细胞洗去,后向每孔加入 0.1 mL
0.125% 胰酶消化细胞,室温放置 1 min,将细胞充分消化下来,然后将消化下
来的细胞吸入 1.5 mL 的 EP 管中,离心 1000 rpm,3 min,弃上清,用 PBS 洗涤
3 遍,将胰酶洗净后用 0.5 mL PBS 重悬细胞,用流式细胞仪检测分析细胞中的
荧光强度。
3.3 结果
3.3.1 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP纳米粒子的细胞毒性研究
3.3.1.1 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP纳米粒子的细胞毒性检测
31
天津医科大学硕士学位论文 三、纳米粒子的细胞毒性及细胞吸收性能研究
本研究采用 MTT 实验评估了 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 聚合物
纳米粒子的细胞毒性及其载药纳米粒子对肿瘤细胞 MCF-7 的杀伤作用,如图 7
所示。可以看出,当 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 纳米粒子在浓度低
于 100 μg/mL 时细胞生存活性在 80% 以上,未显示出明显细胞毒性。
Fig 7 Relative cellular viability of MCF-7 cells after treatment with
P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP nanoparticles
图 7 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 聚合物纳米粒子处理 MCF-7 细胞后
细胞相对生存率
3.3.1.2 载 DOX聚合物纳米粒子和游离 DOX的细胞毒性比较
接下来,采用 MTT 实验针对 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 载 DOX
聚合物纳米粒子对肿瘤细胞 MCF-7 的杀伤作用进行了进一步检测和评价,结果
如 图 8 所示。 在载药纳米粒子中,随 DOX 浓度 增加 ,负载 DOX 的
P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 纳 米 粒 子 和
P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-AuNP 纳米粒子分别处理的 MCF-7 细胞活性均显示
得到很好的抑制,二者的 IC50 分别为 0.33 μg/mL 和 0.65 μg/mL。结果表明,有
FA 修饰的载药纳米粒子比没有 FA 修饰的载药纳米粒子表现出对肿瘤细胞更好
的杀伤性能。但与游离 DOX 的 IC50(0.11 μg/mL)相比,二者对肿瘤细胞的杀
伤能力相对较低,这主要是因为 DOX 在纳米粒子中的释放较慢,在检测时间内
未完全释放。当负载 DOX 的 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 纳米粒子中
DOX 浓度为 5 μg/mL 时,约 94% 的 MCF-7 细胞被杀死,此时载体纳米粒子的
32
天津医科大学硕士学位论文 三、纳米粒子的细胞毒性及细胞吸收性能研究
浓度约为 10 μg/mL,由图 7 结论可知,此浓度,远远低于载体纳米粒子本身有
细胞毒性的浓度。
这 些 结 果 表 明 , MCF-7 细 胞 可 更 准 确 高 效 地 摄 取 负 载 DOX 的
P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 纳米粒子,并在肿瘤细胞内更多地释放出
DOX 进而发挥杀伤作用,减少对正常组织细胞的伤害。
Fig. 8 Relative cellular viability of MCF-7 cells after treatment with DOX loaded
P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP nanoparticles, DOX loaded
P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-AuNP nanoparticles and free DOX.
图 8 负载 DOX 的 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 纳米粒子,负载 DOX
的 P(MATIB-co-MBA-co-GMA) -AuNP 纳米粒子和游离 DOX 处理后的 MCF-7 细
胞相对生存率
3.3.2 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 纳米粒子的细胞吸收和体外靶向性能
研究
3.3.2.1 激光共聚焦荧光显微镜成像
33
天津医科大学硕士学位论文 三、纳米粒子的细胞毒性及细胞吸收性能研究
如 图 9 所 示 , 分 别 将 终 浓 度 为 1 μg/mL 的 负 载 DOX 的
P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 纳 米 粒 子 和
P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-AuNP 纳米粒子与人乳腺癌 MCF-7 细胞孵育 0.5 h
后 , 从 共 聚 焦 荧 光 显 微 镜 的 观 察 结 果 可 以 看 出 , 在 负 载 DOX 的
P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 纳米粒子处理的细胞中可以看到明显的
红色 DOX 荧光,说明 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 纳米粒子可以携载
DOX 很好的进入细胞,而 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-AuNP 纳米粒子携载 DOX
的入胞能力明显较差。
Fig.9 Confocal fluorescence microscope photos of MCF-7 cells incubated with
DOX-loaded P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP nanoparticles and
DOX-loaded P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-AuNP nanoparticles at 37 oC for 0.5 h.
图 9 MCF-7 细胞的共聚焦荧光显微镜图片,分别经负载 DOX 的
P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-AuNP 纳米粒子和负载 DOX 的
P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 纳米粒子处理
3.3.2.2 流式细胞仪检测
接 下 来 , 本 研 究 采 用 流 式 细 胞 分 析 仪 测 评 负 载 DOX 的
P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 纳米粒子在体外细胞中的药物传递能力,
34
天津医科大学硕士学位论文 三、纳米粒子的细胞毒性及细胞吸收性能研究
对照组选用以负载 DOX 的 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-AuNP 纳米粒子处理组
和未经处理的空白细胞组。如图 10 所示,未经处理的空白细胞组荧光强度几乎
为零,而负载 DOX 的 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 纳米粒子处理组的
荧光强度明显强于 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-AuNP 纳米粒子处理组,这一检
测结果与激光共聚焦荧光显微镜结果表现一致。
说明经 FA 修饰的载体纳米粒子对肿瘤细胞具有一定的主动靶向性,能够被
FA 受体高表达的 MCF-7 细胞更高效地结合和摄取。
Fig.10 Flow cytometry results of untreated MCF-7 cells, MCF-7 cells incubated with
P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP nanoparticles and DOX-loaded
P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-AuNP nanoparticles at 37 oC for 0.5 h.
图 10 负载 DOX 的 P(MATIB-co-MBA-co-GMA) -AuNP 纳米粒子和负载 DOX 的
P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 纳米粒子分别处理的 MCF-7 细胞的流式
检测结果
3.4 讨论
3.4.1 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP纳米粒子的细胞毒性研究
3.4.1.1 聚合物纳米粒子的细胞毒性检测
理想的药物传递载体应当同时具备药物负载率高,释放速率稳定和细胞毒
35
天津医科大学硕士学位论文 三、纳米粒子的细胞毒性及细胞吸收性能研究
性低等特点。本实验中要考察药物载体 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP
聚 合 物 纳 米 粒 子 的 体 外 毒 性 , 选 用 的 是 MTT 试 验 法 。 MTT , 全 称 为
3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide,即 3-(4,5-二
甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐,商品名:噻唑蓝, 是一种黄色粉末状
化学试剂,也可作为一种黄色染料。MTT 法是检测细胞生长和存活情况的一种
方法。其检测原理如下:在活细胞线粒体中存在一种特殊的还原性酶,叫琥珀
酸脱氢酶,它能将外源性的 MTT 还原为结晶——甲瓒,该结晶呈蓝紫色,且不
溶于水,可在活细胞内沉积,而死细胞不存在上述反应,因此,可用来检测细
胞的存活情况。DMSO 能溶解活细胞中的甲瓒结晶,然后,在 490 nm 波长处,
用酶标仪测定其吸光度值(OD 值)。在一定范围内,吸光度值与结晶形成的量成
正比,而 MTT 结晶的量与活细胞的数量成正比。因此,根据所测得的 OD 值,
可判断活细胞的数量,OD 值越大,活细胞数量越多,如果是检测药物毒性,则
表 示 药 物 的 细 胞 毒 性 越 小 。 如 图 7 所 示 , MTT 试 验 结 果 显 示 ,
P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 聚合物纳米粒子在浓度增加到 1000
μg/mL 时 , 并 未 明 显 抑 制 MCF-7 细 胞 的 生 长 , 表 现 出 低 毒 特 性 , 当
P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 纳米粒子浓度低于 100 μg/mL 时细胞生
存活性在 80%以上,未显示出明显毒性。再次说明了该药物载体的优点。
3.4.1.2 载 DOX聚合物纳米粒子和游离 DOX的细胞毒性比较
继而,本实验仍旧采用 MTT 试验法,评价负载 DOX(载药量为 51.3%)的
P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 聚合物纳米粒子对肿瘤细胞 MCF-7 的杀
伤作用,以相应等量的 DOX 处理组作对照。在载药纳米粒子中,随 DOX 浓度
增 加 , 负 载 DOX 的 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 纳 米 粒 子 和
P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-AuNP 纳米粒子分别处理的 MCF-7 细胞活性均显示
得到很好的抑制,二者的 IC50 分别为 0.33 μg/mL 和 0.65 μg/mL。结果表明,有
FA 修饰的载药纳米粒子对肿瘤细胞表现出更好的杀伤性能。但相比游离 DOX
的 IC5(0 0.11 μg/mL),二者对肿瘤细胞的杀伤能力相对较低,这主要是因为 DOX
在纳米粒子中的释放较慢,在检测时间内未达到完全释放。负载 DOX 的
P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 纳米粒子在 5 μg/mL 的 DOX 浓度下可杀
死约 94% 的 MCF-7 细胞,此时载体纳米粒子的浓度约为 10 μg/mL,纳米粒子
本 身 远 不 至 于 产 生 细 胞 毒 性 。 这 些 结 果 表 明 , 负 载 DOX 的
P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 纳米粒子易被 MCF-7 细胞高效摄取,并
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天津医科大学硕士学位论文 三、纳米粒子的细胞毒性及细胞吸收性能研究
在肿瘤细胞内释放出 DOX 发挥杀伤作用,减少对正常组织细胞的伤害。
3.4.2 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP纳米粒子的体外靶向性研究
3.4.2.1 激光共聚焦荧光显微镜成像
FA分子因其对FA受体高表达的人乳腺癌细胞MCF-7具有特异性亲和作用,
被选作肿瘤靶向小分子。本研究采用激光共聚焦荧光显微镜评估负载 DOX 的
P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 聚合物纳米粒子的体外药物传递能力,以
负载 DOX 的 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-AuNP 纳米粒子处理组作为对照。如
图 9 所 示 , 分 别 将 终 浓 度 为 1 μg/mL 的 负 载 DOX 的
P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 纳 米 粒 子 和
P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-AuNP 纳米粒子与人乳腺癌 MCF-7 细胞孵育 0.5 h
后 , 从 共 聚 焦 荧 光 显 微 镜 的 观 察 可 以 看 出 , 在 负 载 DOX 的
P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 纳米粒子处理的细胞中可以看到明显的
红色 DOX 荧光,说明 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 纳米粒子可以携载
DOX 很好的进入细胞,而 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-AuNP 纳米粒子携载 DOX
的入胞能力明显较差。
3.4.2.2 流式细胞仪检测
如图 10 所示,流式细胞仪检测的进一步检测结果与激光共聚焦荧光显微镜
结果表现一致,并对荧光强度进行了清晰的定量分析,这进一步证明人乳腺癌
细胞 MCF-7 对经 FA 修饰的 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 纳米粒子的
摄取要明显快于对未经 FA 修饰的 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-AuNP 纳米粒子
的摄取。以上结果均与本研究的预期一致,说明经 FA 修饰的该聚合物纳米粒子
对肿瘤细胞具有一定的主动靶向性,其能够被 FA 受体高表达的 MCF-7 细胞更
高效地结合和摄取。
3.5 小结
MTT 实验结果表明,P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 含碘聚合物纳
米粒子本身具有低毒性,有 FA 修饰的载药纳米粒子显示出对肿瘤细胞更好的杀
伤性能,负载 DOX 的 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 纳米粒子易被
MCF-7 细胞高效摄取,并在肿瘤细胞内释放出 DOX 从而发挥杀伤作用,减少对
正常组织细胞的伤害。药物载体的长期体内生物毒性有待进一步研究。另外,
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天津医科大学硕士学位论文 三、纳米粒子的细胞毒性及细胞吸收性能研究
本研究分别采用激光共聚焦荧光显微镜和流式细胞分析仪评估了负载 DOX 的该
聚合物纳米粒子的体外药物传递和释放能力。结果表明,经 FA 修饰的该聚合物
纳米粒子对肿瘤细胞具有一定的主动靶向性,其能够 FA 受体高表达的 MCF-7
细胞更高效地结合和摄取。综上所述,P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 纳
米粒子具有低毒性和肿瘤细胞靶向性,这是其作为极具潜力的新型智能药物载
体的两大优势。
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天津医科大学硕士学位论文 结论
结论
本研究采用沉淀聚合法成功制备了大小均匀、质量可控的含碘聚合物
P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 纳米粒子,该纳米粒子经 FA 表面修饰,
并原位沉积 AuNP,其可作为肿瘤靶向性药物输送载体和 X 线 CT 造影剂。采用
TEM、FT-IR 光谱、UV-vis 光谱、激光粒度仪和 Zeta 电位等表征了该纳米粒子
的表面形态和结构,考察了其载药能力和体外释药性能、细胞毒性及体外靶向
性等,分析了其作为抗肿瘤药物载体的潜力和优势。具体研究如下:
1、 含碘聚合物纳米粒子的制备:首先,以 MATIB 为单体,N,N’-亚甲基双丙烯
酰胺(MBA)为交联剂,通过沉淀聚合反应制备具有交联结构的聚合物纳米粒
子 P(MATIB-co-MBA),在聚合后期加入 GMA,将纳米粒子表面引入环氧基;
第二阶段用乙二胺 EDA 修饰纳米粒子 P(MATIB-co-MBA-co-GMA),使其表面氨
基化;肿瘤靶向分子 FA 随后被连接到该纳米粒子上,以增加其肿瘤细胞主动摄
取率;最后,以纳米粒子 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-EDA-FA 为核心沉积金纳
米粒子,即合成用于肿瘤靶向性 X 线 CT 造影剂和抗肿瘤药物传递的多功能含
碘纳米粒子 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-EDA-FA-AuNP。
2、 聚合物纳米粒子的表征:TEM 图片表明,所制备的纳米粒子均为表面光滑、
粒径均匀的球形,并具有较好的分散性。P(MATIB-co-MBA-co-GMA)纳米粒子
平均粒径为 102 nm,当表面修饰了 FA 分子并沉积了 AuNP 后,所得的
P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 纳米粒子,平均粒径为 135 nm,并且在
其上可观察到均匀分布的粒径小于 5 nm 的 AuNP。FT-IR、UV 检测和元素分析
结果均表明 FA 分子已被成功修饰到聚合物纳米粒子之上。粒径分布及 Zeta 电位
结果分别表明,该聚合物纳米粒子具有良好的物理稳定性。
3、 体外 X 线衰减性能:沉积了 AuNP 的 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP
纳米粒子其 CT 值明显高于相同 I 含量下的 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA 纳米
粒子溶液的 CT 值,说明 AuNP 的掺入显著增强了其 CT 造影性能。
4、聚合物纳米粒子的载药和体外释药性能:结果表明,在一定范围内,
P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 纳米粒子的载药量随着 DOX 溶液初始浓
度的增加而不断增大,而包封率则随着 DOX 溶液初始浓度的增加而不断减小。
当 DOX 溶液的初始浓度为 1500 μg/mL 时,其载药量为 51.3%,包封率为 34.2%。
此时纳米粒子的载药量达到饱和,不再随初始 DOX 的量的增加而增大。DOX
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天津医科大学硕士学位论文 结论
在不同 pH 下的释放曲线表明,6 h 内释药速率较快,之后 DOX 的释放速率变得
缓慢,48 h 后,在 pH 6.0 的 PBS 溶液中 DOX 释放率约为 25%,明显高于在 pH
7.4 的缓冲溶液中的释放速率,说明 DOX 在该纳米粒子中的释放具有一定的 pH
响应性。
5 、 聚 合 物 纳 米 粒 子 的 细 胞 毒 性 : 本 研 究 采 用 MTT 实 验 进 一 步 评 估
P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 纳米粒子的细胞毒性及其载药纳米粒子
对 肿 瘤 细 胞 MCF-7 的 杀 伤 作 用 , 如 图 7 所 示 。 可 以 看 出 , 当
P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 纳米粒子在浓度低于 100 μg/mL 时细胞
生 存 活 性 在 80% 以 上 , 未 显 示 出 明 显 毒 性 。 而 负 载 DOX 的
P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 纳米粒子易被 MCF-7 细胞高效摄取,并
在细胞内释放出 DOX 从而发挥杀伤作用,减少对正常组织细胞的伤害。
6、聚合物纳米粒子的体外靶向性:本研究分别采用激光共聚焦荧光显微镜和流
式细胞分析仪评估了负载 DOX 的 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 纳米粒
子的体外药物传递能力。结果一致表明,经 FA 修饰的纳米粒子对肿瘤细胞具有
一定的主动靶向性,其能够通过受体介导的内吞作用被 FA 受体高表达的 MCF-7
细胞更高效地结合和摄取。
综上所述,本研究采用沉淀聚合法制备了 FA 修饰并沉积了 AuNP 的含碘聚
合物 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 纳米粒子,该纳米粒子粒径均匀、
质量可控。通过 TEM、FT-IR 光谱、UV-vis 光谱、激光粒度仪和 Zeta 电位等表
征了该纳米粒子的表面形貌和结构。体外 X 线 CT 成像性能和细胞实验结果表
明,该纳米粒子具有较好的 X 线衰减效应、较好的肿瘤细胞靶向性和较低的细
胞毒性,并可以高效携载抗肿瘤药物进入肿瘤细胞并杀死肿瘤细胞。结果表明,
本研究制备的 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP 含碘聚合物纳米粒子显示
了可同时作为 X 线 CT 造影剂和抗肿瘤药物输送的能力,有潜力成为肿瘤诊治
一体化的诊疗剂。
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天津医科大学硕士学位论文 发表论文及参加科研情况说明
发表论文及参加科研情况说明
在学期间发表论文情况:
[1] 朱颖,张岩,陈妍,杨晓英. 用于肿瘤靶向性 X 线 CT 造影剂和抗肿瘤药物
传递的多功能含碘纳米粒子的制备和表征[J].天津医科大学学报,2018,
24(2):122-130.
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综述
纳米 CT造影剂的新进展
计算机断层扫描(CT)是目前临床上应用最广泛的一种医学成像形式。为
提高 CT 成像的灵敏度,人们通常会借助适量小分子含碘化合物作为造影剂。然
而,碘化物造影剂主要经肾排泄,且在体内循环时间较短。而有些诊断需要造
影剂在体内经历较长的循环时间,传统碘造影剂肾清除较快,体内停留时间过
短,这不仅制约了这些造影剂的使用效果,而且还会增加肾脏发生严重不良反
应的风险。另外,临床 CT 通常使用高能 X-线,而碘对 X-线的衰减效率并不高,
只是灵敏度不够。由于传统碘化物造影剂的这些限制,纳米级碘 CT 造影剂逐渐
发展起来,该新型造影剂不仅能延长体内循环时间,还能减少不良反应的发生,
除碘之外,许多重金属原子的纳米粒子如金、镧系元素以及钽等已逐渐被应用
于更高效的 CT 造影剂。在本篇综述中,整理总结了纳米级 CT 造影剂的研究新
进展。
1 引言
计算机断层扫描(CT)是目前应用最普遍的一种非侵入性临床成像形式,
这主要是由于其适用广泛,效率高,成本低以及新型混合成像系统的快速发展,
如正电子放射断层扫描(PET)/CT 和单光子发射计算机断层扫描(SPECT)/CT.[1]。
CT 扫描仪是由高弗雷·豪斯费尔德在百代唱片(EMI)有限公司开发的,并于 1972
年使用一台原型 CT 扫描仪(Mark I)首次进行临床试验。[2]CT 成像对临床医学
影响巨大,1979 年豪斯费尔德被授予诺贝尔医学奖。由于能形象地呈现身体内
部结构,CT 成像成为诊断疾病、治疗预测和疗效评估的常规检查手段。[3]尽管
有人担心 X-射线的辐射,[1]CT 成像仍然在病情诊断中扮演重要角色。根据 IMV
医疗信息部门最新调查显示,在美国全年 CT 扫描的数量已由 2007 年的 68 700
000 例增加到 2010 年的 81 900 000 例。与 PET 相比,CT 能以更高分辨率提供
3D 组织细节,使目标区域之外的叠加消除,可显著改善成像效果。[3]通常核磁
共振成像需要几分钟时间,而 CT 成像能在较短时间达到较高的分辨率,甚至能
快速捕捉到心脏的跳动。[4]这是因为 CT 原理是依靠组织上的 X-射线衰减,它能
提供高电子密度材料的图片。然而,尽管 CT 成像比传统放射线照相术有更高的
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分辨率,但它仍然很难清晰辨认软组织的细微变化,因为大多数软组织在 0~50
HU 之间有非常相似的 CT 值。因此,为了更好地描述目标部位的细微变化,我
们需要借助外源 CT 造影剂。根据 IMV 调查显示,2010 年, 55%的 CT 扫描需
要使用 CT 造影剂。
硫酸钡混悬液和水溶性的碘化芳香化合物是目前最常用的 CT 造影剂。[5,6]
由于 Ba+ 离子固有的毒性,硫酸钡的使用仅限于胃肠道成像。目前常用的注射
造影剂是含碘化合物,然而由于碘造影剂在体内停留时间短,阻碍了其更广泛
的应用。而且,尽管碘造影剂通常是安全的,但由于其较高的渗透压和粘性,
有时会发生严重的不良反应。[7]尽管我们需要新的更安全的 CT 造影剂和更灵敏
的成像,但是由于 CT 灵敏度较低,目前并没有什么进展。例如,尽管 MRI 能
监测到微摩尔浓度的造影剂,但毫摩尔的浓度则需要借助 CT 成像。[8]磁性粒子
所产生的强大磁场使得核磁成像小于像素大小,[9]甚至能显示出单个细胞(粒径
≤10 µm)。[10]但这种扩大效果对于 CT 成像几乎是不可能实现的,因为 CT 造影
与重原子和 X-射线的相互作用有关。另外,具有 X-射线衰变的材料都具有较高
的原子质量,且大部分都有毒。
在过去的十年中,纳米技术已经得到了巨大发展,[11]多种纳米材料被引入
生物医学应用中。[12]值得注意的是,这些纳米材料随着体积不同或配位分子不
同,其药代动力学、生物分布和毒性也不同。[13]纳米粒子有更长的循环时间,
还可设计为靶向组织的输送载体。[14]另外,对纳米粒子表面适当修饰可具备各
种多功能用途,如多通道成像,或同时具有诊断和治疗功能。[15]基于上述原因,
纳米级粒径 CT 造影剂具有巨大的发展潜力。[16]目前已经有一些文章描述小分子
CT 造影剂,如芳香碘和金属盐,[5,6]在本综述中,将主要介绍纳米粒径的 CT 造
影剂及其应用。
2 CT 的原理
2.1 X-射线的产生
金属阳极和阴极碰撞产生的高压可使电子加速,这一过程可产生 X-射线。
在 CT 中,钨是一种常用的阳极材料,因其具有较高的原子量和高熔点。有两个
过程能产生 X-射线:韧致辐射和特征辐射(图 1)。当阴极的高速电子被阳极材
料原子核附近的电场分散时,它们的动能转化为 X-射线光子,该光子具有连续
光谱,被称为韧致辐射(图 1a)。如果入射电子与阳极金属原子的内层电子发生
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碰撞(如 K 层),则绑定电子将会被驱逐(喷射)出来。空缺则由更高能级的外
层电子(M 或 L 层)填充,致使能量等于两个能级层能量差的 X-射线光子的发
射,被称为特征辐射(图 1b)。
图 1 X-射线的产生。
对于韧致辐射,X-射线光子的能量和数量(keV)取决于电压峰值(kVp)
和 X-射线管允许的电流值(mA)。X-射线光子的最大能量与管电压的峰值能量
一致,但是具有最高能量的光子的数量却很少。X-射线光子的数量与它的能量
成反比。然而事实上,典型的 X-射线散射光谱在中间能级产生一个峰值,因为
大量的低能级光子被阳极吸引(图 1c)。另外,当 X-射线穿过物体时,低能量
的 X-射线很容易被吸收,而平均能量增加(被称为射束硬化效应)。由于人工制
品的射束硬化效应,低能量的 X-射线通常被金属滤波器过滤。同时,管电压也
直接影响 X-射线产生的效率,如果管电压增加,在整个能量范围的光子的数量
也增加。对于特征辐射,辐射强度取决于管电压和 K 层电子键能的能量差,如
果管电压小于电子的能量,将不会产生特征辐射。
2.2 X-射线与物质的相互作用
如伦琴射线图像所示,X-射线的一个著名特点是具有很强的穿透力,使得
X-射线可以用来诊断。然而,并不是所有的 X-射线光子都能穿透物体,它们一
部分被吸收,还有一部分被物体内部相互作用分散。由于吸收和分散导致的 X-
射线强度减弱被称为 X-射线衰减。X-射线衰减程度用公式表示
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I=I0-μx (1)
其中 I 是射出 X-射线强度,I0 是入射 X-射线强度,μ 是物体的衰减系数,
x 是物体的厚度。
X-射线与物体的内部相互作用分为三种类型:相干散射、康普顿散射、光
电效应(图 2a)。在相干散射中,也称为瑞利散射、汤普森散射或经典散射,入
射 X-射线的能量被原子吸收,具有相同能量 X-射线光子作为主要的 X-射线以任
意的方向被射出,因为相干散射主要发生在较低的 X-射线光子能级,在大多数
临床应用中贡献较小。
当入射 X-射线光子与原子外层电子发生碰撞时会产生康普顿散射,碰撞之
后,X-射线的一部分能量转化为电子的动能,而 X-射线光子发生偏转的同时能
量减少。由于外层电子的键能很小,发生偏转的 X-射线光子的能量取决于入射
X-射线光子的能量。当初始能量较大时,转化的能量较小,并且散射光子与原
始 X-射线光子的方向差异也较小。但在诊断成像中,入射 X-射线光子的能量并
没有那么大,散射发生在各个方向,导致成像的信噪比降低。康普顿散射取决
于物体的电子云密度而与原子质量无关。在 CT 成像中,散射射线结果要来自于
病人的身体。由于到达监测器的光子越多,X-射线的能量就越强,因此 X-射线
能量越高,则射线曝光将会减少。然而,X-射线的能量越高,组织间的衰减系
数差异亦越小(图 2b)。因此,CT 造影中使用的 X-射线能量要平衡影象对比度
和 X-射线的剂量。
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图 2 (a)X-射线与物质的相互作用。(b)几种材料作为 X 射线能量的质量衰减
系数
光电效应是 CT 造影剂 X-射线衰减的最主要因素。在光电效应中,入射 X-
射线光子将能量传递给内层电子,随后从原子射出,内层电子的空缺(以 K 或 L
层为代表)由外层电子补充,并向任意方向产生特征 X-射线光子,当入射 X-射
线能量比内层电子能量稍微大一点时,最有可能产生光电效应。如果光子的能
量低于键能,光电效应将不会发生,这是因为当 X-射线光子的能量较高时,产
生光电效应的机率与入射 X-射线能量的立方成反比(1/E3)。例如,碘的 K 层电
子键能为 33 keV,当入射光子能量小于 33 keV 时,将会主要与 L 层电子发生相
互作用,当能量稍微大于 33 keV 时,光子则能与 K 层电子发生相互作用,导致
质量衰减系数突然增大,当光子能量超过键能时,与束缚电子紧密相关的光电
效应发生概率较大。因此,X-射线衰减效应与材料的原子质量的 3 次方成正比。
表 1 描述了在 100 keV CT 成像中几个重金属原子原子序数,K-edge 能量,X-
射线的质量衰减系数。
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表 1 CT 成像中几个重金属原子原子序数,K-edge 能量,X-射线的质量衰减系数
近年来,一种新型的能量转化 CT 逐渐发展起来,也被称为多彩 CT 或光谱
CT。[17]光谱 CT 需使用一种特殊的检测器,这种检测器能将 X-射线区分为几个
能量窗。由于每种材料都有独特的能量相关的 X-射线衰减和 K-edge 间隔,因此
光谱 CT 能区分内生不透射线的结构(如骨骼)和各种外源的造影剂。近来有使
用光谱 CT 成功区分金、碘和磷酸钙的报道。[18]
2.3 CT 成像的原理
CT 图像是通过旋转的 X-射线管和位于被检测病人身体另一侧的检测器得
到的(图 3a)。[4]X-线束在穿过病人身体时被组织和造影剂吸收或偏转,从而发
生衰减。检测器所检测到的 X-射线强度与其轨道中在体素的衰减效应的总和有
关(图 3b):
其中 I 表示 X-射线强度,I0 是指 X-射线的初始强度,i 代表照射路径中的体
素,μi 是体素中材料的衰减系数,xi 是体素的维数。
在 X 光管和检测器的旋转过程中,可以从多个角度获得一系列衰减的剖面
图。随后,使用代数重建技术(ART)得到衰减系数的代表性数列。用适当的灰
度表达结果,将获得的每种体素的衰减系数转换为 CT 数值,如下:
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其中 μv 是体素的衰减系数,μw 是水的衰减系数。
尽管 CT 数值非常小,为纪念 Godfrey Hounsfield 的巨大贡献,采用
HU(Hounsfield unit)作为 CT 的单位。基于这个方程,空气的 CT 值为-1000 HU,
水 CT 值为 0 HU,而致密的骨骼 CT 值接近+1000 HU。因此,人体中 CT 值从
肺部的-1000 HU 到骨骼的+1000 HU 有一个很大的跨度范围。但这个大的范围还
是有问题的,因为人体大多数软组织的 CT 值大约在 40~80 HU。因此,需要选
择一个适当的成像范围来适应窗宽(所显示 CT 值的范围)和窗位(CT 数据的
中心)。
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图 3 (a)三代 CT 的原理图。(b)立体像素衰减的剖面图
尽管在适当的窗宽和窗位中能够在 CT 成像中显示出细小的不同,但对比分
辨率还与扫描仪的噪声大小有关。为了得到可靠的区别,扫描仪信噪比至少要
达到 3~5。[19]一台临床扫描仪的噪声约为 1~3 HU,可以检测到病变部位为 5~10
HU。为了达到这种 CT 对比,需要使用约 0.5 mg/ml 金纳米粒子,[20]与许多在毫
摩尔浓度范围具有分子靶向表达相比,这是很高的浓度。[21]基于这一原因,使
用 CT 进行分子成像是非常困难的。纳米粒径的 CT 造影剂就很有优势,因为许
多重原子能被输送到我们所需要的靶向受体。
3 以碘为基础的造影剂
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由于碘具有较高的原子质量,碘造影剂在临床 CT 造影中广泛应用。[6]碘造
影剂具有相当长的历史,可追溯到 20 世纪 20 年代。第一个 X-射线碘造影剂是
碘化钠,但是它的毒性限制了其进一步应用。[5]当今大多数碘造影剂为 1,3,5-碘
基苯的衍生物(图 4)。在碘化芳烃上引入羧基和氨基等官能团能增加其生物相
容性和水溶性。第一代 X-射线碘造影剂,包括泛影酸盐,是由三碘苯单体和苯
甲酸离子组成(图 4a)。由于 CT 成像需要注射大量的造影剂,因此离子造影剂
介质的高渗透压受到格外关注。为解决这一问题,非离子水溶性碘造影剂日渐
发展起来(图 4b)。这种造影剂具有较低的渗透压,降低了不良反应发生的风
险。还可通过增加每摩尔分子所含碘原子的数量,进一步降低造影剂的渗透压
(图 4c 和 4d)。通过共价键将两个碘化芳烃连接成的二聚体,与血液有几乎相
等的渗透压,且表现出很好的耐受度。但是,如之前所述,这些碘造影剂会经
过肾脏快速排泄,仅允许很短暂的造影时间。另外,这些造影剂在血管内和血
管外的特殊分布,导致 CT 成像不清楚。为解决这些限制,纳米级的碘造影剂,
如胶束、聚合体和脂质体,已开始逐渐发展起来。[16]
图 4 含碘 CT 造影剂的化学结构。(a)离子单体(b)非离子单体(c)离子二聚
体(d)非离子二聚体
3.1 含碘胶束纳米乳
胶束是指一种胶体分散状态,它是当水溶液中两性表面活性剂达到临界胶
束浓度(CMC)以上时自然形成的。[22]胶束的大小通常在 10 到 200 nm 不等,
且适当的稳定胶束存在能延长体内循环时间。但是,当静脉注射 CMC 以上的胶
束溶液时会在体内分解成单体,这是因为血液的稀释作用将它的浓度降到 CMC
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以下。为解决这一问题,采用 CMC 非常低的聚合物胶束比传统表面活性剂更适
合体内应用。胶束的核心由表面活性剂的疏水端组成,如此可以溶解多种水不
溶性化合物,包括一些药物、纳米粒子和造影剂。利用这一性质,de Vries 等人
研究出用聚丁二烯-聚乙二醇(PBD-PEO)和 3,7-二甲辛基-2,3,5-三碘代苯甲酸
酯(图 5)来做 CT 造影剂。[23]而使用 1,2-二硬脂酰甘油-3-磷酸胆碱磷脂(DSPC)
则会显示出一定的毒性,大约是因为它胶束稳定性较低,而胶束稳定性较高的
PBD-PEO 表现出更高的生物相容性和更好的胶束稳定性。稳定性越高允许的含
碘量也越高(130 mg I/ml), 这使得在体内应用很占优势。这种胶束用于 CT 血
池成像中,在小鼠体内的循环半衰期约为 3 h。
图 5 纳米乳做 CT 造影剂的原理图
将碘化油乳化支撑纳米乳,然后用表面活性剂吸附稳定已经有很长的历史
了。乙碘油乳剂(碘油或乙碘油)是最早的碘化 X-射线造影剂,它主要由碘化脂
肪酸罂粟油酯类组成。由于它们的亲脂特性,这些乳化剂被用作淋巴管和胃静
脉曲张闭塞造影术。[24]由于碘化油乳剂具有较大的粒径,还可用于动脉化疗
(TACE)。[25]此外,可以使用适当的表面活性剂来控制碘化油乳剂的粒径大小。
之前有研究显示,表面活性剂的亲水亲油平衡值(HLB)和油核心的比例在决
定乳剂粒径方面起重要作用。[24]例如,用二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)制成
的乳剂 HLB 值为 4,粒径为 434.1 nm,而用吐温 80 制备的乳剂 HLB 值为 15,
粒径为 169.3 nm。而且,由于 CT 造影剂需要较大的剂量,所以需要 CT 造影剂
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有更高的浓度。然而,混合高浓度的碘油时常常会降低乳剂的胶体稳定性,并
增大胶束的粒径。为了克服这一困难,研究发现了碘油-胶囊,即用泊洛沙姆/聚
乙二醇交联的纳米胶囊(LPNCs)。[26]然而,传统乳剂是由碘油和泊洛沙姆组成,
其粒径随时间推移不断增长,而 LPNCs 碘油和泊洛沙姆比值为 100%,可保持
稳定的水力直径(约 150 nm),长达 72 h。静脉注射含碘油的 LPNCs 循环时间 4
h,并通过肝脏和脾脏的网状内皮系统(RES)清除。在一份最近报道中,使用
一种不透明聚合物纳米软胶囊(cROMP)可使碘含量接近 37%,这种软胶囊由
交联聚苯乙烯丙烯酸(PS-b-PAA)与碘油组成。[27]在大鼠体内,cROMP 的血浆
半衰期约 56 min,静脉注射后分布在网状内皮系统 RES。胃和胃肠道的造影增
强说明碘分子通过胆汁排泄。
乳剂的疏水性核心使得疏水性药物溶解,诸如紫杉醇、阿霉素以及碘油,
同时促进了 CT 成像和药物转运。例如,在碘油、吐温 80、紫杉醇、荧光染料
和泊洛沙姆 F-68 混合物中,利用相变温度制备多功能纳米粒子,[28]当静脉注射
时,这些纳米粒子就表现出更长的循环时间,进而提高治疗效果。
纳米乳碘化甘油三酯(1,3-二-[7-(3-氨基-2,4,6-三碘苯)-庚酰]-2-油酰甘油
(DHOG),即模孔 LC)也已经发展为有效的 CT 造影剂。[29]由于甘油三酯是乳
糜微粒的主要成分,乳糜微粒可以将外源脂类运输到肝脏,模孔 LC 通过载脂蛋
白-E 受体到达肝细胞,然后内化纳米乳被代谢并通过胆汁排泄。因此,模孔 LC
曾被用于研究肝脏代谢或检测肝脏肿瘤。可以通过联合 PEG 方式延长包含
DHOG 的纳米乳的循环时间,这是因为 PEG 能干涉肝细胞载脂蛋白 E 受体和吞
噬细胞的识别。[30]这种长循环的纳米乳模孔 VC 已经商业化用于血管造影剂。
疏水 DHOG 还能被低密度脂蛋白(LDL)纳米微粒摄取。[31]因为 LDL 细胞表面
受体在某些肿瘤细胞中有过表达,因此这些纳米微粒有用于肿瘤靶向成像的潜
力。
最近,水晶碘化颗粒 N1177(图 6a,6b)被暂停使用,它曾经被用于检测动
脉粥样硬化。[32]N1177 是由碘化芳氧酸酯、PEG、泊洛沙姆 338、氨丁三醇组成。
与普通碘化乳剂通过超声乳化不同,N1177 悬浮液是通过研磨碘化芳氧酸酯获得
的。通过动态光散射测得 N1177 悬浮液的平均粒径为 259 nm,且能稳定存在 8
个月。在家兔体内注射 N1177 悬浮液,体内循环 2 h,并在网状内皮系统丰富的
器官,包括肝脏和脾脏累积。动脉粥样硬化的易破裂碎片是心脏病发作和缺血
性发作的一个诱因,表现出高的巨噬细胞密度。[33]由于巨噬细胞吞噬外源材料
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很活跃,静脉注射 N1177 悬浮液 2 h 后能检测出动脉粥样硬化斑块(图 6c)。
然而,有报道显示,N1177 的转运似乎与内皮组织的渗透性有关。[34]由于 N1177
纳米粒子平均粒径为 259 nm,粒径太大以致于无法穿透未破裂斑块的内皮细胞,
因此需要进一步优化,制备出更高效的临床应用制剂。除了内皮粥样硬化,N1177
还可以用于肺部 CT 成像。[35]非侵入式胸透成像有巨大的潜力,不仅可以用于肺
损伤、疾病、肿瘤转移的诊断,还可以用来检测意外吸入的纳米颗粒。然而,
肺部 MRI 因其大空间和呼吸运动,被认为挑战较大。[36]另一方面,通过吸入方
式给药 N1177,在 3DCT 成像中能清晰地显示气管、支气管、呼吸性细支气管和
外围肺泡结构(图 6d)。
3.2 含碘聚合物造影剂
聚合物 CT 造影剂是由碘化苯甲酸和氨基或羟基基团聚合物反应制备的。[37]
随着表面活性剂的扩散和分解,包埋在胶束内部的小分子会泄露,[22]苯甲酸与
聚合物之间强大的共价键阻止了含碘部分的损失。另外,纳米粒子聚合物的一
些官能团促进了多功能造影剂的发展。
在各种聚合物中,两性物质 AB 型共聚物由 PEG 长链和疏水基团组成,由
于它的低 CMC 值、高稳定性和粒径小等优点很有吸引力。[38]例如,嵌段共聚物
是由碘取代的聚合赖氨酸和甲氧基聚乙二醇(碘化乙醇酸乙酯,图 7a)组成,
这种共聚物可在水溶液中形成稳定的、小于 100 nm 的胶束。[39]由于多种三碘化
苯甲酸之间共轭形成嵌段共聚物,聚合物中的碘含量大约占 45%。胶束在家兔
和大鼠体内循环约数小时,最终在肝脏和脾脏蓄积。
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图 6 N1177 的(a)分子结构和(b)电子显微镜扫面图像,(c)动脉粥样硬化
的体内 CT 成像(d)吸入 N1177 干粉后立即(左)和 2h 后(右)胸腔 CT 3D 结
构图
图 7 (a)碘化乙醇酸乙酯的分子结构(b)MAOETIB 的分子结构
通过乳液聚合碘化物单体 2-甲基丙烯酰(2,3,5-三碘苯甲酸) (MAOETIB),
(图 7b),[40]可以制备更小的辐射透不过的纳米粒子,这种粒子的碘含量可高
达 55%。然后,利用 MAOETIB 和 GMA 的共聚作用来改善纳米粒子的胶体稳定
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性。[41]静脉注射纳米粒子 P(MAOETIB-GMA)后,血相中及吞噬器官(淋巴结、
肝、脾)中的信号会增强。由于纳米粒子会被健康的肝细胞清除,肝脏中的癌
细胞还会在注射 4 h 后显露出来(图 8)。以 P(MAOETIB-GMA)为中心,利用
γ-Fe2O3 纳米粒子在其表面的成核现象,可制备多峰不透射线的磁性粒子。[42]这
种粒子可用于血管栓塞诊断中 CT 和 MRI 对比的媒介。
空心聚合物可将各种小分子 CT 造影剂制成胶囊包裹其中。[43]与胶束不同的
是,胶束是利用亲脂性造影剂疏水的相互作用,而将聚合物封装入胶囊,不仅
可用于疏水造影剂,还可用于亲水造影剂。装载后,聚合物颗粒在略高于玻璃
熔化温度经热处理密封,或与交联剂反应以防止造影剂的损失。[43]但是,这种
聚合物纳米粒子约达到 1 μm,这对于大多数生物医学应用来说有些太大了。
图 8 静脉注射 P(MAOETIB-GMA)纳米粒子小鼠肝癌 CT 图像(a)注射前(b)
注射 3 分钟(c)注射 4 h 后
3.3 含碘树枝状造影剂
树枝状大分子这个术语来自于希腊语 dendri (树)和 mero(部分)。[44]
就像一棵树一样,树枝状大分子由重复单元与内部相连并形成分支组成。与传
统聚合物不同,树枝状大分子是单分散的,并且有明确的结构。典型的树枝状
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大分子有一个核心分子,这个核心是树枝状开始生长的起点,分支单元包围核
心,终端聚合物在外表面生长。分支单元的数量与其繁殖有关,并影响树枝状
大分子的形状和性能。低代繁殖的树状大分子(0 到 3 代)呈现开放式结构,而
多代繁殖的可形成球状结构,内部空洞而外表被终端团体紧密包围。[45]即使每
步反应中,终端反应聚合物的量加倍,多代反应聚合物的修饰仍需要更长的反
应时间。迄今,4 代繁殖的树枝状大分子通常被用于 CT 造影剂的研究。在这些
报告中,亲水性芳香族碘化物被嫁接在其表面,碘化树枝状大分子以 PEG 连接
作为核心,聚赖氨酸作分支,碘比醇作 CT 造影分子(图 9a)。由于这种树枝状
大分子在体内循环时间长,已被用于 CT 血管造影剂(图 9b)。随后,这种树
状分子用于评价肿瘤细胞中血管渗透性。当造影剂浓度一定时,CT 可提供定量
信息,当使用血管生成抑制剂时,PEG12000-Gen4-triiodo 可监测肿瘤细胞中微
血管变化。[46]
含碘芳香化合物嫁接到聚酰胺-胺(PAMAM)树枝状大分子聚合物被认为是
很有发展潜力的 CT 造影剂。[47]但是,PAMAM 具有很强的正电性,可破坏细胞
膜并产生巨大的毒性。[48]另外,PAMAM 静脉注射后会很快从血液中清除。因
此,需要将其乙酰化或聚乙二醇化,减弱其正电性,并形成分子较稳定的空间
构象。[49]连接含碘分子后,剩余的胺与其他成份一起可用于进一步结构修饰,
从而合成多功能的造影剂。近年来,有研究通过连接三碘苯酸(TIBA)与 99m Tc[50]
提升单光子发射计算机化断层显像(SPECT)和 CT 成像。该研究呈现延长体内
循环时间,并提高了 SPECT 的灵敏度和 CT 的空间分辨率。
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图 9 (a)树状碘化物造影剂 PEG12000-Gen4-triiodo 的分子结构(b)大鼠在注
射 PEG12000-Gen4-triiodo 后 1,10,20,30 min 一系列最大强度预测的 CT 血管
造影图像
3.4 含碘脂质体造影剂
脂质体是由脂质双分子层自行组装而成的囊泡,可将水性核心锁在里面。
(图 10)[51]与胶束只可承载脂溶性分子不同,脂质体亲水和亲脂的分子都可运
输。脂质体是非常灵活多变的载体,因为它磷脂有各种各样的组成,可以在其
表面修饰各种分子,例如 PEG、放射性同位素、抗体以及金属螯合物等。[52]迄
今,一些脂质体药物在艾滋病相关的卡波西肉瘤和卵巢癌中的治疗效果已经被
临床认可。[53]
起初脂质体 CT 造影剂是用来装载水溶性碘化造影剂。[54,55]由于这些造影剂
会被网状内皮系统迅速清除,通常主要用于肝脏或脾脏等固体肿瘤的检测。将
水溶性碘造影剂包封于水溶性内芯仍是应用最广泛的方法,因为这种造影剂无
需修饰即可产生商业效益。与内芯是脂溶性的造影剂不同,最近通常将脂质体
造影剂修饰上 PEG 来增加其体内循环时间。[19]获得长的体内循环时间后,这些
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天津医科大学硕士学位论文 综述
脂质体也可以用于血管造影成像。使用这种造影剂,大到心脏,小到 100 μm 的
血管都可以使用微 CT 呈现出来。当需要重复做 CT 成像时,长循环脂质体 CT
造影剂就体现出其优势。例如,负载了传统造影剂的碘海醇(欧乃派克 350)可
用于肺栓塞造影。[56]由于脂质体具有高达 3.5 小时恒定的血象造影效果,单剂量
脂质体可用于实时监测纤溶酶原催化剂(t-PA)的治疗效果。为实现精确成像,
同时负载碘海醇和钆特醇可得到多峰造影剂。[57]在大鼠体内注射 3 天后,观察
到主血管的 CT 和 MR 成像造影效果均增强。
图 10 脂质体原理图
静脉渗透后,由于实体瘤血管丰富,血管壁间隙较宽,结构完整性差和淋
巴回流缺失,稳定的脂质体易在肿瘤组织中堆积,被称为实体瘤的高通透性和
滞留效应(EPR 效应)。[58]利用这一性质,聚乙二醇化的负载碘克沙醇脂质体
可用于小鼠初期肺癌的观察。[59]此外,在特定区域,CT 数值与造影剂浓度呈线
性分布,因此 CT 还可提供定量信息。由于纳米载体传送的量与肿瘤脉管系统的
泄露程度有关,因此,脂质体 CT 造影剂可用于检测肿瘤治疗的效果。[60]此外,
化疗药物和 CT 造影剂可以被同时包裹进去。先前有报道显示,当脂质体同时负
载碘克沙醇和阿霉素时,肿瘤信号强度与等量阿霉素相比有明显增强。[60]另外,
在实体瘤的靶向治疗中,长循环的脂质体还可更容易显现出新发展的肿瘤血管
(图 11)。[61]
通过分别在亲水性内核装载亲水性造影剂和脂质双分子层装载亲脂性造影
剂,可以增加含碘化合物的负载量。例如,负载碘帕醇(水溶性含碘化合物)
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天津医科大学硕士学位论文 综述
和碘油的脂质体可用改良的反向蒸馏法制得。[62]碘油的增加并没有改变脂质体
的性质,例如装载碘帕醇的容量和平均颗粒大小。被注入的脂质体可被网状内
皮系统清除,与游离碘帕醇或脂质体单纯负载碘帕醇相比,混合负载的脂质体
可实现更强的 CT 造影效果。
由于化学电位不同,合并的造影剂可能会透过生物膜扩散出来。[51]而生物
膜的渗透性与其硬度或结晶度有关,所以当制备脂质体时,通常引入胆固醇。[63]
众所周知,胆固醇对脂质体的稳定性起关键作用。不含胆固醇的脂质体在体内
循环过程中,会被高密度脂蛋白(HDL)打破平衡。另外,磷脂结构对脂质体
的稳定性也起重要作用。[65]当温度高于 37℃时,磷脂会发生一个相的转变(如
L-α-二油酸磷脂酰胆碱),此时脂质体会具有更坚硬的膜结构。为避免碘化分子
的渗漏,碘以共价键的形式连接进入脂质双分子层。[65]碘化的脂质体可通过磷
脂酰胆碱来修饰。含双碘代磷脂酰胆碱的脂质体的大小从 50 ~150 nm 不等。当
在其水溶性内核引入碘海醇后,脂质体中碘的浓度显著增加,可达到 28%。
尽管临床上习惯于使用脂质体 CT 造影剂,但是脂质体含碘造影剂与游离碘
造影剂在药代动力学和毒理学上表现不同。游离碘化合物可迅速经肾脏排泄,
而脂质体含碘造影剂可经网状内皮系统 RES 缓慢清除。例如,包含碘克沙醇脂
质体复合物可被肝脏吸收,随后经过生物转化。[66]质谱分析和酶反应显示,一
个或两个己糖通过 O-α1-糖苷键连接到碘克沙醇上。在人类的 I 相研究中,给予
高剂量的脂质体碘造影剂(70~100 mg I/kg)可引发较弱不良反应,包括寒颤、
背部疼痛、类似感冒症状以及恶心呕吐等。[67]
3.5 碘化金属有机框架
碘化金属有机框架(MOFs)由过渡金属和锯齿状的桥接配体组成。[68]由于
金属离子和有机基团可广泛任意连接,可制备各种不同的 MOFs。用 2,3,5,6,-四
碘代-1,4-苯二羧酸(I4 -BDC-H2)作为碘化物桥接配体与 Cu2+或 Zn2+离子结合,
可制得 CT 成像用的纳米级 MOFs(图 12)。[69]碘代 MOFs 作为 CT 造影剂与
碘克沙醇相比表现出相当的效果。值得注意的是,MOF 在 37 ℃下,磷酸盐缓
冲液(PBS)中,可在 46 小时内完全分解,这体现了它的生物可降解特性。
64
天津医科大学硕士学位论文 综述
图 12 碘化金属有机框架的结构
4 金纳米粒子
金纳米粒子因其独特的性质和高生物相容性,已经受到广泛地研究,用于
生物医学应用领域。[12]迄今,已经制备出各种各样的金纳米结构,包括金球、
金棒、金壳以及金笼等等。[70]因金纳米粒子的光学特性,通过调整它的形状或
聚集状态,可用于生物诊断试验、光热治疗、表面增强拉曼光谱(SERS)、光
声成像和可控释药等等。[71]此外,通过各种配体修饰(如 PEGH 和寡核苷酸),
可对硫醇表面表现出很高的亲和力。[72]金是一种非常惰性的材料,适当稳定的
金纳米粒子具有很高的生物相容性。之前有研究显示,当金纳米粒子浓度达到
3.2 g Au/kg 时,才会有很高的半数致死量 LD50。[73]当需要高剂量 CT 造影剂时,
金纳米粒子这种高的生物相容性表现出很大的优势。
4.1 金纳米粒子作为 CT 造影剂
由于其较高的原子序数(Z=79)和 k 阶能(80.7 keV),金纳米粒子通常比
碘造影剂具有更高的对比度。在更高的 X-射线管电压下,金与碘对 X-射线的衰
减表现出更大的差异。例如,在 80 kVp 下,金纳米粒子的声噪比只比碘普罗胺
的声噪比高 14%,而在 140 kVp 时,两者差值可达到 115%。[74]当 X-射线穿过
65
天津医科大学硕士学位论文 综述
病人身体时,射线的平均能量会增加,因为低能量的射线会被身体吸收或散射。
因此,碘的造影效果取决于它所处的环境,碘对于低能量的 X-射线敏感。碘在
水中或在含磷酸钙的水溶液中对 X-射线的衰减明显低于碘在空气中对 X-射线的
衰减。相比之下,无论是在水中或是在磷酸钙水溶液中,金纳米粒子对 X-射线
的衰减并未明显减少(图 13)。[74]以上结果表明,金纳米粒子具备 CT 造影剂
的很大潜力,因为 CT 造影通常选用高能 X-射线。
图 13 在不同环境和管电压下含碘造影剂(a)和金纳米粒子(b)的衰减率
平均粒径约为 1.9 nm 的金纳米粒子,是最初被研究作为 X-线造影剂的。[73]
因为其粒径小,可以经肾脏排泄。尽管金纳米粒子与传统碘造影剂的排泄路径
相似,但它的清除率更低,可在体内停留更长的成像时间。静脉注射金纳米粒
子后,在体内X射线成像能详细的揭露组织结构,比如肿瘤和直径小于 100 μm
的血管。之后,各种各样的金纳米粒子被研究用于 CT 造影剂。在制造金纳米粒
子的各种方法中,在水溶溶液中用柠檬酸将 HAuCl4 还原(被称之为 Turkevich
法)是目前应用最广泛的方法之一。[70]由于柠檬酸稳定的金纳米粒子在生物媒
介中并不稳定,人们通常通过配位体交换,用硫醇化 PEG 修正。与非常小的金
纳米粒子(~2 nm)相比,PEG 包裹的金纳米粒子(~30 nm)可在 RES 系统,
像肝脏、脾脏等器官中富集更多。[75]注射 PEG 包衣的金纳米粒子后,通过 CT
可看到正常肝细胞和肿瘤细胞之间清晰的界线轮廓,因为只有肝细胞薄壁组织
含有吞噬细胞。虽然金-硫键很牢固,但是硫酯键极易被含硫醇的生物分子取代,
如二硫苏糖醇和谷胱甘肽。[72]因此,3,4-二羟基苯丙氨酸(DOPA)配体已被用
于金纳米粒子的强还原剂。[76]肝素-DOPA 包裹的金纳米粒子显示出极好的稳定
性和肝选择性。[77]除了图尔克维奇法,金纳米粒子还可以通过直接还原含金的
前体,在适当的配体下制得。最近,以植物化学阿拉伯胶(GA)为基质的金纳
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天津医科大学硕士学位论文 综述
米粒子已用于猪的 CT 造影,猪的生理学和解剖学上均与人类相似。[78]GA-金纳
米粒子表现出极好的生物相容性,且在肝脏和脾脏的 CT 造影效果显著。
由于树状大分子内部具有空洞结构,因此可作为合成金纳米粒子的模板,
且使其具备相对一致的大小,约 3 nm 左右(图 14)。[79]通过修饰树状大分子
的终端基团可以控制金纳米粒子树状复合物的性质。金纳米粒子通过乙酰化树
状大分子可避免与细胞膜间的非特异性相互作用,并展现出很高的生物相容性。
[80]当对大鼠腹膜内注射纳米粒子时,一部分通过腹膜毛细血管网吸收,缓慢运
送至肿瘤组织。有趣的是,静脉注射给药后,乙酰化的金纳米粒子树枝状大分
子比聚乙二醇(PEG)化的金纳米粒子大分子,在体内的循环时间更长。[81]但
是,PEG 化的金纳米粒子树枝状大分子在 pH 5~8,温度 4~50 ℃条件下保持稳
定。另外,静脉注射后,已成功应用于体内血池和肿瘤组织的成像。树枝状截
留的金纳米粒子复合物对 X-射线的衰减会随着金纳米粒子的进一步生长或引入
碘化物分子而增强。[82,83]通过还原氯金酸钠,然后合并泛影酸(DTA)分子,
可得到泛影酸金纳米粒子复合物。[82]若先添加泛影酸,而后还原氯金酸钠,则
得到的纳米粒子为胶束不稳定体系。如果金纳米粒子被截留在大分子内部的空
穴中,那么可连接的泛影酸数会由 107 降至 59,与 Au-DENP 和欧乃派克相比,
Au-DENP-DTA 表现出更明显的 X-射线衰减。通常不采用直接合并碘化物分子,
而是采用种子生长法,通过用抗坏血酸将树枝状聚合物截留的金纳米粒子还原。
[83]通过调节金离子和金纳米粒子的比率,可将纳米粒子的直径控制在 3~8 nm。
67
天津医科大学硕士学位论文 综述
聚合物浓度相同时,纳米粒子越大,表现出的 CT 造影效果越强。
图 14 树枝状含金纳米粒子造影剂的制备流程图
4.2 金纳米棒作为 CT 造影剂
除了球形的金纳米粒子,金纳米棒也可以用作 CT 造影剂。[84]虽然金纳米粒
子的形状并不影响 CT 造影的效果,但是,金纳米棒对于开发多功能造影剂具有
很大的潜力,因为它在近红外光区域有很强的荧光猝灭。而且,据了解金纳米
棒能比球形金纳米粒子更好的躲避吞噬细胞的清除,从而具有更长的体内循环
时间。[85]金纳米棒可采用种子生长法由小的金纳米粒子(直径约 1.5 nm),在
溴化十六烷基三甲铵(CTAB)和 AgNO3 条件下,还原氯金酸制得。随后,再
用细胞亲和力强的配体,如硫醇化 PEG 置换出具有细胞毒性的 CTAB。当向肿
瘤组织中注射金纳米棒(约 1 μmol Au),即可通过 CT 造影证实它在肿瘤组织
中的分布。
4.3 金纳米材料为基础的靶向 CT 造影剂
为了获得细胞学和分子进程的信息,通常采用 CT 造影,就需要靶向 CT 造
影剂。尽管肿瘤组织可以通过 EPR 效应被动靶向药物检测,但主动靶向能都更
高效更具体。[20]金纳米粒子因其表面易于修饰,具有靶向成像的优势。例如,
硫醇化 2-脱氧葡萄糖(2-DG)通过简单的配位交换,很容易在金纳米粒子表面
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天津医科大学硕士学位论文 综述
形成共轭。[86]由于肿瘤细胞新陈代谢较快,2-DG 包裹的金纳米粒子比非靶向金
纳米粒子更容易被肿瘤细胞吸收,从而表现出更高的 CT 造影价值。虽然硫醇化
配位体交换比较简单易行,但是游离硫醇在其周围环境中很容易被氧化成二硫
键,而且硫醇化作用优势会影响配体的功能。因此,通常采用碳酰亚胺、马来
酰亚胺和点击化学法发生偶合反应。UM-A9 靶向鳞状细胞瘤(SCC)抗体就是
在金纳米棒表面共轭聚丙烯酸(PAA),用 EDC 和 NHS 催化。[84]靶向金纳米
棒培养的鳞状细胞瘤细胞比非靶向培养的细胞呈现高出 5 倍的 CT 值。而且,同
组实验显示,金纳米粒子共轭连接抗表皮生长因子受体(EGFR),体内主动靶
向比被动靶向更高效。[87]主动靶向的提高似乎取决于肿瘤细胞较高的吸收率,
以及纳米粒子表面靶向配体和肿瘤细胞受体之间强大的相互作用。除肿瘤细胞
外,金纳米粒子与 CD4 抗体共轭还可用于外周淋巴结的 CT 研究(图 15)。[88]
更大的靶向纳米粒子,因其能装载更多的金纳米粒子,比相对较小的和非靶向
纳米粒子具有更高的造影加强效果。
69
天津医科大学硕士学位论文 综述
图 15 大鼠注射金纳米粒子之前(a,b)和之后(c,d)的 CT 图像
4.4 金纳米材料为基础的多功能 CT 造影剂
为了更精确地诊断,金纳米粒子为基础的多功能造影剂逐渐发展起来。为
了开发多种模式造影剂,还需考虑各种成像模式的敏感度差异。例如,基于铂
Pt 的高原子质量,Fe-Pt 纳米粒子可用于 CT/MRI 双模式成像。[89]然而,要多种
模式同时成像,Pt 的量要远远高于 Fe 的量,以为 Pt 的 CT 敏感性很低。
金纳米粒子包覆钆 Gd 螯合物可用于 CT 和 MRI 的造影剂。[90]该纳米粒子
可以通过在硫醇化螯合物条件下还原氯金酸盐,或者通过柠檬酸金纳米粒子的
配位体交换制得。金纳米粒子结合 Gd 螯合物的功能化使得 MR 造影效果和 CT
造影效果得以实现。钆 Gd 的 X 射线衰减效果比碘 I 高,在金浓度相同条件下,
Gd 包裹的金纳米粒子比没有结合 Gd 的表现出更高的 CT 值。在纳米粒子表面共
轭 Gd 螯合物的翻滚速率比无 Gd 螯合的明显降低,致使存在更高的弛豫效能。
[91]金纳米棒具有更多 Gd 螯合的有效结合位点,因为它有更高的表面积体积比。
[90]Gd 螯合金纳米棒的弛豫效能经测量分别为 21.3 mM−1·s−1 每 Gd 离子和
1.1×107 mM−1·s−1 每粒子。
在纳米粒子表面吸附拉曼受体并用 PEG 稳定,即可得到用于 SERS 和 CT
的金纳米粒子。[92]皮下注射纳米粒子可以通过 CT 扫描和 SERS 成像检测。由于
每个拉曼受体呈现唯一的拉曼光谱,特定的受体染色剂可以很容易的从混合纳
米复合物种得到辨识。[93]因此,肿瘤组织可以先通过 CT 扫描显露,然后再通过
拉曼散射提供其分子水平上的具体信息。
众所周知,金纳米粒子具有荧光淬灭特性,[94]因此荧光成像中荧光染料修
饰的金纳米粒子很少受到关注。然而当荧光分子非常接近金属表面时才发生淬
灭效应。因此可通过在纳米粒子和染色剂之间嵌入一个分隔层克服淬灭现象。
介孔材料二氧化硅包覆的金纳米棒装载吲哚菁绿(ICG)已成功用于 CT 和荧光
双重成像。[95]此外,金纳米粒子的淬灭效应还促进了激活探针的发展。基质金
属蛋白酶(MMP)在肿瘤组织中有过表达,为显示其活性,用金纳米粒子共轭
环磷酰胺 Cy5.5 实现 MMP 可激活的多肽类示踪(图 16)。[96]Cy5.5 共轭金纳米
粒子的荧光淬灭和黑洞淬灭可以在 MMP 溶液中得到恢复。静脉注射纳米粒子
后,肿瘤组织可以在 CT 和荧光成像下完全显现。
70
天津医科大学硕士学位论文 综述
图 16 (a)基质金属蛋白酶(MMP)可用于金纳米粒子 CT/荧光双重成像探针
的原理图(b)大鼠注射纳米粒子后 24 h 肿瘤分布的 CT 图像(中)和近红外图
像(右)
除了有机分子的多功能化,如生成螯合物和拉曼散射,多功能纳米粒子还
可通过连接两个不同种类的纳米粒子制得。所得到的异质结构纳米粒子可同时
具备其中各个单体成分的性质。[97]例如,铁/金复合纳米粒子不仅表现出氧化铁
纳米粒子的超顺磁特性,还同时具备金纳米粒子的辐射不能透过的性质。[98]铁/
71
天津医科大学硕士学位论文 综述
金复合纳米粒子可以通过两种方法制得,一种是在预先合成的氧化铁纳米粒子
表面聚集金纳米粒子,[96]另一种是一步合成法,通过热分解金油酰胺和油酸铁。
[99]由于金和氧化铁都具有很好的生物相容性,当今临床中该混合纳米粒子应用
于肿瘤检测也具有很大的潜力。[98]
通过硫醇化低聚核苷酸使金纳米粒子功能化,可作为靶向检测核酸序列灵
敏的检测剂。[71a]细胞吸收后,结合的寡核苷酸被细胞内的还原性分子释放出来。
[100]利用这一性质,siRNA/AuNP/L-PEI 复合物可用作 siRNA 的转运工具和 CT
造影剂。[101]虽然 PEI 是非常高效的转染剂,但由于其高正电荷导致的毒性是一
个非常严重的问题。[102]由于 siRNA-AuNP 多聚体的电荷密度增加,复合物比单
体 siRNA 的 N/P 比低,因此具有更低的毒性。乳腺癌细胞孵化后,用
siRNA/AuNP/L-PEI 复合物处理的细胞比单体 siRNA/L-PEI 复合物处理的细胞表
现出更强的基因沉默效率和更高的 CT 值。
像抗体一样,寡核苷酸适配子具有寡核苷酸的功能并且能跟靶向分子结合。
[103]而且有数据显示,可将 DOX 插入 C=G 碱基对中。[104]利用这些性质,可以
合成靶向前列腺癌细胞的多功能纳米粒子,通过将前列腺生物膜抗原(PSMA)
RNA 适配体与 21 个碱基对相连。[105]靶向的前列腺癌细胞显示对连接 PSMA 适
配体的金纳米粒子更高的吸收率,比非靶向 PC-3 细胞的 CT 值高 4 倍。金纳米
粒子平均可装载 615 分子 DOX,对 LNCaP 细胞表现出更高的细胞毒性。
5 结论与展望
尽管已经有很久的历史,CT 成像仍然在临床实践和基础生物科学领域有很
大的发展前景,给多彩 CT 成像这种先进的 CT 技术提供巨大的希望。新的 CT
造影剂具备适当的 K 键能和长的体内循环时间,期望能加速 CT 成像的革新。
尽管人们对纳米粒子 CT 造影剂的关注不及核磁共振成像 MRI 和荧光成像等其
他造影形式,但近几年,人们对 CT 造影剂的关注度快速发展起来。由于静脉注
射纳米粒子后,会经过网状内皮系统 RES 富集的器官(如肝脏)清除,因此纳
米级 CT 造影剂可用来诊断肝癌和肝转移。另外,长循环的纳米粒子对血管和肿
瘤形象化有重要意义。尽管 CT 成像的一个相当大的阻碍是靶向成像灵敏度较
低,但纳米粒子可将大量重原子运送到靶向区域,提供更加灵敏的成像和个体
化诊断。而且纳米粒子经过灵活的表面修饰,使得产物造影剂功能多样化,连
接每个模型的优势,使得成像更加精确。尽管目前可用的碘造影剂由于其 K 键
72
天津医科大学硕士学位论文 综述
能较低,还不可用于多色 CT。新型的 CT 造影剂以生物相容性好的重原子,如
金、钽、铋、镧系等,可以克服此限制,允许不同的材料用单一的成像识别。
尽管新的 CT 造影剂正在被广泛研究,但仍没有统一标准将它们的性能进行
分级。[106]文献显示,成像效果通常用 CT 数值显示(Hounsfield 为单位),但
CT 数值与造影剂的浓度息息相关,在不同的报告中,很难将不同的材料进行对
比。为了更精确地分析,需要一个像 MRI 里 r1,r2 弛豫效能一样的浓度依赖型的
参数,如 CT 值与造影剂浓度呈线性相关,其斜率可用来评价造影效果。值得注
意的是,X 射线衰减依靠扫描参数,如 X-射线管电压、核心重构和物理环境。
因此需要一个标准协议来评价 CT 成像效果。此外,这些技术的临床应用还需对
纳米粒子的生物相容性进行进一步研究。由于大多数重金属离子在人体内不存
在,目前对其在体内的降解、代谢和消除过程知之甚少。另外,还需考虑新造
影剂的经济成本,因为成功的 CT 成像通常需要较大量的造影剂。基于上述原因,
新造影剂的益处将逐步显现。
73
天津医科大学硕士学位论文 综述
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