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烤肉及其模拟体系中杂环胺和晚期糖基化终末产物 的联动效应研究

时间:2022-05-21来源:博士论文

热加工肉制品普遍存在杂环胺(Heterocyclic amines,HAs)和晚期糖基化终末产物 (Advanced glycation endproducts,AGEs)等多类美拉德反应危害物,但目前的研究多 仅关注某一类危害物。为了同时控制多类危害物,首先需要阐明多类危害物的生成及抑 制过程中的互作关系和联动效应。HAs 和 AGEs 这两类危害物有共同的反应前体、类似 的反应途径及共有活性羰基化合物中间体,理论上其生成途径存在交联。基于此,本论 文首先采用多响应动力学建模及稳定同位素标记技术研究烤肉模拟体系中 HAs 和 AGEs 同步生成规律,从而阐明反应前体共存条件下的互作关系,进一步察常用抗氧化剂 EGCG 在前体共存反应体系中对 HAs 和 AGEs 的联动效应。最后,考察实际烤肉中 HAs 和 AGEs 生成动力学及常用食品配料多聚磷酸盐对这两类危害物生成的影响。以期为危 害物多目标控制提供理论依据和参考。模拟体系中所研究的两类 HAs 为喹(喔)啉类和 吡啶类 HAs,两种典型 AGEs 为羧甲基赖氨酸(Nε-carboxymethyl-lysine,CML)和羧乙 基赖氨酸(Nε-carboxyethyl-lysine,CEL)。 论文首先建立了喹(喔)啉类 HAs 和 AGEs 同步生成模拟体系(赖氨酸/苏氨酸/葡 萄糖/肌酸酐)(IQ-A 体系)。多响应动力学建模基于建立机理模型和所测定反应前体, α-二羰基化合物、2,5-二甲基吡嗪中间体和终产物(CML、CEL、MeIQx、7,8-DiMeIQx 和 4,8-DiMeIQx)浓度的变化。利用所计算的动力学参数阐明喹(喔)啉类 HAs 和 AGEs 的互作关系。研究发现,葡萄糖裂解生成丙酮醛反应速率常数小于通过 Amadori 重排产 物降解途径的速率常数;在 150℃下,CML 通过 Amadori 重排产物氧化生成途径的反应 速率常数(k7=3.794×10-3 min-1)是通过乙二醛与赖氨酸反应生成 CML 速率常数 (k8=1.815×10-3 L mol-1 min-1)的 2 倍,但随着反应温度的升高 k7 接近 k8;MeIQx、7,8- DiMeIQx 和 4,8-DiMeIQx 3 种 HAs 的速率常数值最低(9.831×10-10 ~1.305×10-7L mol-1 min-1)。这些结果表明,丙酮醛的形成主要源于 Amadori 重排产物的降解;低温时 CML 主要由 Amadori 重排产物氧化生成,温度升高后 Amadori 重排产物氧化途径和乙二醛和 赖氨酸反应途径对 CML 的贡献同等重要;吡嗪与肌酸酐生成 HAs 是关键限速步骤。 论文同时建立了吡啶类 HAs(PhIP)和 AGEs 同步生成模拟体系(赖氨酸/苯丙氨酸 /葡萄糖/肌酸酐)(PA 体系),采用多响应动力学建模考察其互作关系。多响应动力学建 模基于所建立的反应网络和所测定的反应前体,α-二羰基化合物、苯乙醛和终产物(CML、 CEL 和 PhIP)。研究发现,乙二醛与赖氨酸反应生成 CML 的速率常数(k6)小于通过美 拉德反应中间产物 Amadori 重排产物氧化生成 CML 的速率常数(k10)(7.264×10-3、 1.317×10-2 和 2.241×10-2 min−1)。通 过 Amadori 重排产物氧化产生 CEL 的速率常数(k11) 为(5.807×10-3[200℃]、8.704×10-3[200℃]、1.250×10-2[200℃] min−1)大于丙酮醛与赖氨 酸反应产生 CEL 的速率常数(k5)(k11> k5)。苯乙醛与肌酸酐反应生成 PhIP 具有最低的 速率常数。这些结果表明,CML 主要源于 Amadori 重排产物氧化,且随温度升高其贡 献增大;CEL 生成途径中 Amadori 重排产物氧化途径比丙酮醛与赖氨酸反应贡献大;肌 酸酐与苯乙醛反应是 PhIP 生成途径中的速率限制步骤。 I 摘 要 上述两个动力学模型说明 HAs 和 AGEs 两类美拉德反应危害物生成途径中的互作 关系。为阐明 HAs 和 AGEs 同步生成体系中共有前体葡萄糖碳原子在反应产物中的分 布情况,采用[U-13C6]葡萄糖稳定同位素记实验进行分析。LC-MS 或 GC-MS 分析反应 产物发现,葡萄糖以 C3 片段的形式形成丙酮醛,2,5 二甲基吡嗪大部分 C 源于葡萄糖裂 解的 C3/C3,葡萄糖裂解的 C2 和 C3 片段分别参与了 CML 羧甲基基团碳原子、CEL 羧乙 基基团上的三个碳原子,葡萄糖的 C3/C1 片段或两个 C3 一个 C1 片段参与了 MelQx 的生 成;葡萄糖中 C 原子并未进入苯乙醛和 PhIP 分子。 之后,考察了典型抗氧化剂 EGCG 对 IQ-A 体系和 PA 体系中 HAs 和 AGEs 联动效 应的影响。200℃加热反应过程中 IQ-A 体系多响应动力学发现,由 Amadori 重排产物氧 化(k7)和由乙二醛与赖氨酸反应生成 CML(k8)的速率常数分别增加了 681%和 1006%; CML 的降解速率常数(k13)也增加 766%且(k13>k7 和 k8)。表明,高温下 EGCG 对 CML 的抑制可能与其促进 CML 降解途径有关。EGCG 存在下,MeIQx、7,8-DiMeIQx 和 4,8- DiMeIQx 生成速率常数分别下降 40%、40%和 44%,表明 EGCG 可以通过抑制 2,5-二甲 基吡嗪与肌酸酐反应对这 3 种 HAs 形成抑制。EGCG 对 PA 体系中 PhIP 和 AGEs 联动 效应表现为,EGCG 存在下,乙二醛与赖氨酸反应生成 CML 的速率常数增加约 65%。 EGCG 能够使苯丙氨酸与丙酮醛反应生成苯乙醛途径的速率常数(k8)降低 75%,同时 还降低苯乙醛与赖氨酸反应速率常数(k12 下降 88%),因此,EGCG 通过抑制苯丙氨酸 与丙酮醛反应,同时促进苯乙醛降解,从而降低苯乙醛含量。EGCG 存在下,苯乙醛和 肌酸酐反应生成 PhIP 的速率常数下降 77%,显著抑制 PhIP 生成。 为了探讨实际烤肉中 HAs 和 AGEs 的生成情况,考察了实际烤牛肉饼在 150、175、 200、225°C 条件下烤制 5~50 min(每面烤制 1/2 总时间)HAs 与 AGEs 的动力学变化规 律。结果表明,烤肉中 HAs 和 AGEs 的生成规律可能符合一级反应动力学,MeIQx 和 PhIP 的活化能高(34.12±7.86 和 28.19±8.07 kJ/mol),对温度更敏感;而 CML 和 CEL 活 化能较低(19.55±5.25 和 9.36±0.41 kJ/mol),相对低温条件下就能生成。艾林方程考察 速率常数与温度间的关系,HAs 和 AGEs 的活化熵(∆S#)<0,表明其形成遵循双分子 机理。 最后,系统考察了不同离子强度的三聚磷酸钠(TPP)、焦磷酸钠(PP)和 NaCl 对 烤肉饼中 HAs 和 AGEs 的影响。结果发现,225℃烤制 20 min 后,添加不同离子强度的 NaCl(或)多聚磷酸盐会使烤制损失显著降低(p<0.05),水分含量显著升高,烤肉硬度 增大,烤肉饼表面温度升高,且肉饼离子强度越高,表面温度越高。NaCl 和多聚磷酸盐 显著增加烤肉饼中 PhIP、喹( 喔 )啉(MeIQx、4,8-DiMeIQx 和 IQ)和 β-咔啉(Harman 和 Norharman)、总杂环胺、CML 和 CEL 含量(p<0.05)。NaCl 和多聚磷酸盐处理的烤 肉饼中 PhIP、MeIQx、4,8-DiMeIQx、IQ、harman 和 norharman、CML 和 CEL 含量均与 肉饼水分含量、烤制损失显著相关(p<0.05)。牛肉饼中 HAs 和 AGEs 含量的增加可能 与盐的促氧化作用有关,但主要原因是高离子强度引起的烤肉饼表面温度升高所致
杂环胺,晚期糖基化终末产物,多响应动力学,EGCG,联动效应,离子强度
烤肉及其模拟体系中杂环胺和晚期糖基化终末产物 的联动效应研究

第一章 绪论
1.1 肉制品中多元危害物研究现状及存在的问题
流行病学数据和动物研究都证实了肉制品相关的饮食在疾病发展中的重要作用,因
为富含蛋白质的肉制品在热加工过程中,可能会产生致癌化合物以及引发人体代谢性疾
病的化合物。这些化合物包括 N-亚硝基化合物(N-nitrosocompounds,NOC)、多环芳烃
(Polycyclic aromatic hydrocarbons,PAH)、以及美拉德反应有害物,包括:丙烯酰胺、
杂环胺(Heterocyclic amines,HAs)和晚期糖基化产物(Advanced glycation endproducts,
AGEs)等。N-亚硝基化合物主要由高温下分子氮氧化进一步使肉类食品中的仲胺和酰
胺亚硝化产生;多环芳烃多由有机化合物不完全燃烧产生,在熏肉、烤肉中常见;丙烯
酰胺主要是天冬氨酸与还原糖通过美拉德反应途径生成,主要在富含淀粉食品中产生。
HAs 和 AGEs 也是美拉德反应途径中产生的危害物,这两类危害物有共同的反应前体、
类似的反应途径及共有的活性羰基化合物中间体[1]。
美拉德反应主要指含氨基化合物(蛋白质和氨基酸)和还原糖羰基之间的化学反应,
通常发生在食品贮藏、热加工过程中,能显著改善热加工食品颜色和风味。但是,美拉
德反应也会引起食品蛋白质营养品质的损失及潜在的具有遗传毒性、致突变性和致癌性
化合物的生成[2]。HAs 是通过美拉德反应在 100°C~300°C 加工过程中产生,如煎炸和烤
肉中。现已发现超过 25 种 HAs。国际癌症研究中心(IARC)已将 AαC、MeAαC、PhIP、
MeIQ 和 MeIQx 列为 2B 级致癌物,IQ 为 2A 级。此外,美国卫生和公众服务部的国家
毒理学计划也将 IQ、MeIQ、MeIQx 和 PhIP 列为合理预期的人类致癌物[3]。富含蛋白质
食品在高温烹调加工中不仅容易产生 HAs,还容易产生 AGEs[4]。现有研究证实,膳食
中的 AGEs 对体内 AGEs 的积累有重要作用,并与氧化应激和炎症相关,这些过程最终
导致大多数慢性疾病发生,如肥胖、2-型糖尿病及心血管疾病[5]。
热加工肉制品中危害物的研究,大多致力于生成机制、反应途径、影响因素、控制
方法等,对各类危害物的生成途径都有了大体较为清晰的认识[2,6,7]。基于对各类危害物
生成途径,也开发出不同的抑制方法,例如清除自由基、捕获中间体、与前体竞争性反
应等[3,8,9]。然而,迄今为止,HAs 和 AGEs 这两类危害物都是各自研究各自的生成规律
及影响因素,主要在模拟体系中进行,少量在实际体系中进行验证研究。因此几乎所有
研究都是仅研究某类或者某种危害物,缺乏在相同热反应条件下进行的生成规律或抑制
效应的关联研究,而在实际食品中,这两大类危害物的反应前体是共存的。
目前主要的问题是两类美拉德反应危害物前体同时存在情况下,热加工条件下彼此
间是否相互影响,是否存在此起彼伏的问题,即对多元危害物的相互作用和联动问题。
理论上,这两类危害物有类似的反应条件、共同的反应前体还原糖、共同的一些反应中
间体例如二羰基化合物,因此这两类危害物反应途径间存在关联。因此,本文选择高温
加工肉制品中普遍存在的两类美拉德反应危害物——HAs 和 AGEs 为研究对象,展开其
联动效应的研究。
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1.2 肉制品中两类美拉德反应危害物
1.2.1 HAs 种类和生成途径
根据 HAs 的化学结构,可将其分为三类(图 1-1):咪唑喹(喔)啉类(IQ-型)(IQ、
MeIQ、MeIQx、4,8-DiMeIQx 和 7,8-DiMeIQx 等)、咪唑吡啶类(PhIP、DMIP、TMIP 等)
和咔啉类(β-咔啉,harman 和 norharman 等)。按杂环胺生成条件又分为两大类:一类
为“热解 HAs”或非 IQ 型化合物,这类化合物产生于单个氨基酸的高温热解(>250℃),
如色氨酸、苯丙氨酸等氨基酸。第二类 HAs,称为氨基-咪唑氮-杂芳烃类(Amino-imidazo-
azaarenes,AIAs),其生成温度在 150℃~250℃,主要包括咪唑喹(喔)啉和吡啶类化合
物。
图 1-1 咪唑喹(喔)啉类(IQ-型)(A)、吡啶类(B)和咔啉类(C)HAs
Figure 1-1 Chemical structures of imidazoquino(xa)line (IQ-type) (A), pyridine (B), and carboline (C)
heterocyclic amines
由于 HAs 种类繁多,结构复杂,生成机制也很复杂,目前的研究,仅有少量 HAs
如 IQ-型、PhIP 生成途径相对清晰[10]。IQ、MeIQ、MeIQx、4,8-DiMeIQx 和 7,8-DiMeIQx
的生成途径相似,正常烹饪(如油炸、烧烤和烘烤)温度低于 300°C 时容易生成。喹(喔)
啉类 HAs 的三种主要前体是肌酸/肌酸酐、糖和氨基酸。喹(喔)啉类 HAs(IQ-型)的
生成可能是羰基途径和自由基途径的结果。(1)美拉德反应途径(图 1-2):还原糖如己
糖与氨基酸通过美拉德反应或 Strecker 降解形成醛类、吡啶或吡嗪,醛、吡啶或吡嗪与
肌酸酐通过羟醛缩合反应生成相应的 IQ-型化合物[11]。(2)自由基途径:其机理是,还
原糖和氨基酸通过逆醇反应生成乙二醇醛烷基亚胺(烯醇型),然后通过美拉德反应产
生不同类型 HAs[7]。其中,涉及双分子环的形成,从烯醇形式的糖醛烷基胺,然后氧化
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第一章 绪论
形成自由基。自由基的另一个途径是乙二醛单烷基胺生成 N,N-二烷基吡嗪离子,然后还
原生成自由基[7]。产生的烷基吡啶自由基和二烷基吡嗪自由基与醛和肌酐反应,分别形
成喹啉或喹喔啉类 HAs[2]。但是,自由基机制仍然存在争议[12]。
图 1-2 咪唑喹啉或喹喔啉类 HAs(IQ-型)美拉德反应生成途径[2]
Figure 1-2 Maillard reaction pathway of imidazoquino(xa)line (IQ-type) heterocyclic amines
PhIP 形成机制始于苯丙氨酸和肌酸酐的反应,苯丙氨酸经 Strecker 降解生成苯乙醛,
然后,苯乙醛与肌酸酐发生羟醛缩合,最终生成 PhIP[12](图 1-3)。PhIP 分子中的含氮
吡啶部分来源于肌酐的氨基,或苯丙氨酸或游离氨的氨基。在含有葡萄糖和肌酐的模拟
反应体系中使用 13C 标记苯丙氨酸的实验表明,13C-苯丙氨酸参与 PhIP 分子的 C-5、C-
6 和 C-7 形成。此外,酪氨酸和亮氨酸也是生成 PhIP 的前体氨基酸[13]。
图 1-3 由苯丙氨酸和肌酸酐反应形成 PhIP 途径[12]
Figure 1-3 Formation pathwary of PhIP from phe and creatinine
关于氨基咔啉类 HAs 生成途径的研究较少,harman 和 norharman 等 β-咔啉类 HAs
首先色氨酸在葡萄糖存在下经美拉德反应形成色氨酸 Amadori 重排产物,然后在活性羰
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基化合物参与下进行环化(Pictet-Spengler 反应)生成四氢-β-咔啉,经氧化最终生成 β-
咔啉[2](图 1-4)。由 于 β-咔啉类 HAs 是动植物中存在的一类生物碱,其本身并没有毒性
[14]。因此,此类 HAs 不在本文的研究计划之列,本文重点关注喹(喔)啉类 HAs 和吡
啶类 HAs(PhIP)。
图 1-4 β-咔啉类 HAs 生成途径[2]
Figure 1-4 Formation pathway of β-carboline heterocyclic amines
肉制品中因含有生成 HAs 所需的前体肌酸、氨基酸和还原糖,因此 HAs 广泛存在
于此类食品中。表 1-1 归纳了常用热加工方式处理不同类别肉及制品中 HAs 含量,其含
量均在 ng/g 水平。然而,不同肉制品在不同热加工条件下产生的 HAs 种类和含量差异
很大。肉制品中最常见的 HAs 是 PhIP、MeIQx、4,8-DiMeIQx、MeIQ、harman 和
norharman[2,3,7]。例如,大多数研究中 PhIP 浓度在 1~320 ng/g 之间;然而,7,8-DiMeIQx
含量低于 0.1ng/g,
可检测到 MeIQx 浓度高达 23 ng/g,4,8-DiMeIQx 的浓度低于 1 ng/g。在一些研究
中,IQ 低于检测限。此外,Haskaraca 等人[15]调查过快餐店购买的鸡肉汉堡中 HAs 含
量,发现 MeIQx 是所有分析样品中的主要 HAs(表 1-1)。不同热加工方法对不同肉制
品 HAs 的形成有不同的影响。此外,肉制品中 HAs 含量还受原料肉种类、前体含量、
脂肪含量、热加工温度、时间等因素的影响[3]。热加工温度越高、时间越长,HAs 含量
越高。大多数情况下,应考虑热加工温度和时间的组合来分析 HAs 的生成。
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第一章 绪论
表 1-1 常见肉及肉制品中 HAs 含量
Table 1-1 The content of HAs in meat and products under different heating conditions
肉类型 加工方 加工温度时间 HAs 类型 含量 测定 参考文献
法 方法
牛肉 烤 180℃,10 min IQ 0.92~2.10 ng/g HPLC-MS Szterk,
280℃,7 min MeIQx 2.39~11.11 ng/g
[16]
MeIQ 1.71~5.33 ng/g
4,8-DiMeIQx 4.52~7.55 ng/g
Harman 5.93~19.53 ng/g
Norharman 2.57~5.07 ng/g
Phe-P-1 2.51~3.34 ng/g
PhIP 3.14~11.80 ng/g
AαC 0.35~0.54 ng/g
鸡胸肉 煎 180℃, 10 min IQ, 1.76±0.68 ng/g HPLC–UV Liao et
MeIQx, 1.83±0.86 ng/g al.[17]
4,8-DiMeIQx, 1.05±0.40 ng/g PhIP 18.33±3.63 ng/g
烤 200°C, 20 min PhIP 0.04±0.01 ng/g HPLC–UV Liao et
al.[17]
培根 煎 150~170°C, MeIQx, 1.5~5.6 ng/g HPLC–UV Gibis, et
3~6 min PhIP, 0.1~2.6 ng/g al.[18]
200~220°C, Norharman, 5.0~19.9 ng/g 2~3 min Harman 0.3~1.7 ng/g
鸡肉汉 煎 170℃, 3 min IQx 1.5~5.6 ng/g HPLC– Haskaraca
170℃, 1.5 min MeIQx nd~3.42ng/g DAD et al.[15]
微波解冻
香肠 干燥 50°C Phe-P-1, 1.66±0.02 ng/g UPLC- Yang et
harman 0.21±0.00 ng/g MS/MS al.[19]
norharman 1.65±0.01 ng/g
焙烤 70℃,20min AαC 0.14±0.00 ng/g
 Phe-P-1 1.02±0.06 ng/g
烟熏 60°C
harman 0.85±0.02 ng/g
norharman 5.81±0.06 ng/g
nd 指未达到检测限
1.2.2 AGEs 种类和生成途径
根据美拉德反应进程,可将其分为初始阶段、中间阶段和末期阶段三个反应阶段。
反应的初始阶段通过氨基羰基相互作用引发糖基化,产生 Amadori 重排产物;中间阶段
为 Amadori 重排产物裂解为二羰基化合物;晚期糖基化以 AGEs 的形成为特征[1]。根据
食品类型和热处理方法的不同,在食品热处理过程中会形成许多不同类型的 AGEs。在
热加工食品中,美拉德反应形成的 AGEs 包括氧化和自由基途径,这些反应可以在蛋白
质中进行形成高分子量 AGEs,或者在氨基酸中进行形成低分子量 AGEs[20]。所有游离
氨基酸都形成 AGEs,但赖氨酸或精氨酸侧链在蛋白质中主导 AGEs 的形成。迄今为止,
在食品及生物样品中发现了超过 20 种 AGEs。基于赖氨酸残基的 AGEs 包括 Nε-羧甲基
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赖氨酸(Nε-carboxymethyl-lysine,CML)、Nε-羧乙基赖氨酸(Nε-carboxyethyl-lysine,
CEL)、吡咯素、乙二醛-赖氨酸二聚体(Glyoxal-lysine dimer,GOLD)和丙酮醛-赖氨酸
二聚体(Methylglyoxal-lyxine dimer,MOLD)等[20]。
AGEs 的定量方法通常采用液相色谱-质谱联用(MS/MS)或高效液相色谱(HPLC-
UV)等[21];然而,没有一种方法能够涵盖所有类型 AGEs。因此,大多数研究使用代表
性 AGEs 进行,最常见的是 CML 和 CEL,通常用作食品中 AGEs 的指标(图 1-5)[20]。
因此,CML 与 CEL 为本文研究的典型 AGEs。
图 1-5 食品中常见 AGEs 结构式
Figure1-5 Structures of selected advanced glycation endproducts (AGEs) in foods
食品中的 CML 和 CEL 除可通过美拉德反应生成。此外,碳水化合物裂解和脂质过
氧化形成的 α-二羰基很容易与赖氨酸残基反应也可生成 CML 和 CEL[22]。美拉德反应途
径中,还原糖与氨基反应生成 Schiff 碱,经 Amadori 重排后生成 Amadori 重排产物,该
过程可生成大量高活性二羰基化合物,如乙二醛和丙酮醛等,这些化合物可与蛋白质的
氨基反应生成稳定不可逆的 AGEs[1]。二羰基化合物生成途径主要包括 Schiff 碱氧化断
裂、葡萄糖自动氧化和脂质过氧化[20]。根据二羰基化合物形成途径的不同,相应 AGEs
可以分为以上三种途径生成。同时,AGEs 可由 Amadori 重排产物经氧化和非氧化途径
直接生成(图 1-6)。CML 通过果糖基赖氨酸氧化和乙二醛与赖氨酸残基反应生成,CEL
通过丙酮醛与美拉德反应中的赖氨酸残基的反应生成[1]。
图 1-6 食品中 AGEs 的生成途径[1]
Figure 1-6 Pathways of formation CML and CEL in food by the reaction between sugar fragmentation
products and amino acids or by autoxidation of sugars
表 1-2 归纳了常见肉制品中 AGEs 含量。食品中 AGEs 含量和种类取决于食品类别、
反应前体含量、过渡金属以及抗氧化剂等多种因素。反应时间、加热温度、反应物浓度
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第一章 绪论
对美拉德反应速率具有决定性影响。Chen 和 Smith[23]用煎烤等常见加工方法制备的鸡
肉、猪肉、牛肉中 CML 含量进行了检测,发现在较高的烹饪温度下烧烤和油炸样品中
CML 含量较高。水煮牛肉糜产生的 CML 远低于煎炸。因此,加工方法和加工温度对
AGEs 的生成有很大影响。此外,脂质氧化产物也能够通过促进反应或与中间体反应改
变美拉德反应途径。
目前对肉制品中 AGEs 的研究,多集中在定性定量分析肉制品中 CML 和 CEL 含
量、影响因素、变化规律等。以及改善热加工工艺和添加植物抗氧化剂抑制 CML 和 CEL
的生成。尽管研究人员已经提出美拉德反应途径中,AGEs 与 HAs 共有途径及共同中间
产物,但针对这两类危害物互作关系的研究尚未有涉及。在接下的章节中将重点讨论这
两类美拉德反应危害物反应途径的关联。
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表 1-2 常见肉制品中 AGEs 含量
Table 1-2 The content of AGEs in processed meat products
肉类型 加工方法 加工温度时间 AGEs 含量 测定方法 参考文献
牛肉 油炸 204°C, 20 min (16, 18) CML 17.2~20.0 mg/kg HPLC-FLD Chen 和 Smith[23]
(猪肉 烧烤 232°C, 16 min (14, 16) CML 19.7~21.8 mg/kg
、鸡肉) 烘烤 177°C, 45 min (35, 35) CML 13,6~14.3 mg/kg
生肉 1.5~2.1 mg/kg
牛肉糜 煮 CML 5.1 mg/kg UPLC-MSMS Assar, et al.[24]
牛肉糜 油炸 CML 11.2 mg/kg UPLC-MSMS
牛肉 烤 日常加工条件 CML 7.3~14.3 mg/kg protein UPLC–MS/MS Hull et al.[25]
鸡肉 烤 CML 17.4 mg/kg protein UPLC–MS/MS
煮 CML 17.2 mg/kg protein UPLC–MS/MS
煎 CML 23.5 mg/kg protein UPLC–MS/MS
鳕鱼 煮 CML 0.8±0.04 mg/kg protein UPLC–MS/MS
烤 CML 3.7±0.2 mg/kg protein UPLC–MS/MS
烧烤 CML 3.7±0.2 mg/kg protein UPLC–MS/MS
猪肉 商业灭菌 121°C, 10 min CML 11.5~12.1 mg/kg protein HPLC-MS/MS Niu, et al.[26]
CEL 7.56~8.59 mg/kg protein
猪肉 商业灭菌 121°C (5~30 min) CML 58.5±1.6 mg/kg protein (10min) HPLC–MS/MS Sun,et al.[27]
121°C (5~30 min) 85.4±4.9 mg/kg protein (30min)
CEL 29.8±8.2 mg/kg protein (10min)
43.5±7.2 mg/kg (30min)
牛排 煎 CML 15.7 mg/kg LC-MS Gómez-Ojeda et al.[28]
培根 煎 CML 17.2 mg/kg LC-MS Gómez-Ojeda et al.[28]
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第一章 绪论
1.2.3 HAs 和 AGEs 反应途径共有活性羰基化合物
美拉德反应涉及自由基和活性羰基。自由基途径在 HAs 生成过程尚有争议,而活性
羰基化合物在 AGEs 和 HAs 生成途径都有产生。通过大量的模拟体系研究,在单独生成
AGEs 体系或 HAs 体系中,各自的反应途径大体清晰[9,29–31]。其中,产生 HAs 所需的活
性羰基中间体有许多不同的来源,包括碳水化合物、脂类和氨基酸。碳水化合物主要通
过美拉德反应产生活性羰基化合物,其在风味和褐变中发挥重要作用[32,33]。食品中碳水
化合物产生的活性二羰基最为丰富的是 3-脱氧葡萄糖酮、3-脱氧半乳糖酮和葡萄糖酮,
此外 C2、C3 活性二羰基化合物包括乙二醛和丙酮醛[12]。Degen、Hellwig 和 Henle 等人
[34]总结了食品中常见 1,2-二羰基化合物的含量。这些活性羰基化合物一旦生成,就会发
生环化反应,形成不同的杂环结构,如呋喃酮、吡喃酮和呋喃衍生物。此外,这些活性
羰基化合物还有助于其他羰基的形成,例如在氨基酸的 Strecker 降解中,吡嗪类化合物
形成。
活性羰基化合物消失的途径之一是参与羰基胺反应。因此,活性羰基化合物与胺、
氨基酸和蛋白质反应生成美拉德反应产物——AGEs。其中 CML 和 CEL,广泛用作食品
营养质量的指标。例如 CML 是乳制品在加热过程所产生,含有高乳清蛋白的婴儿配方
奶粉中存在大量 CML[35,36]。研究最多的活性羰基化合物是乙二醛和丙酮醛。活性羰基化
合物消失的另一个重要途径是与酚类化合物反应。某些酚类物质能够捕获生成 HAs 或
AGEs 所需的活性羰基,从而有效抑制这两类美拉德反应危害物的产生[3,8]。
活性羰基化合物一旦产生,除了参与 AGEs 反应外,还会参与许多其他反应,如 HAs
的生成。所有这些反应之间相互竞争,共用相同中间体,反应途径和倾向取决于所涉及
的反应物的可用性、反应条件和活化能等因素,某些化合物会优先生成。因此,热加工
食品中活性羰基化合物处于不断变化中,有利于羰基化合物生成的条件可能会促进 HAs
或 AGEs 生成,反之亦然。
1.3 两类美拉德反应危害物互作关系研究方法
美拉德反应的速率和形成产物的性质主要由反应条件决定。这些因素包括反应物的
性质、酸碱度、水分活度、氧气和金属的存在、加热过程中的温度-时间组合以及反应抑
制剂的存在等。然而,时间、温度对反应速率的综合影响与食物体系最为密切。这些因
素共同作用,决定了食品加工过程中美拉德反应的进程,从而对加工食品的品质有很大
影响。
在实际肉制品中,HAs 和 AGEs 两大类危害物的反应前体共存下,热加工过程中这
些典型危害物的前体、中间产物与产物之间的关系尚不明确。因此想要同步控制复杂体
系中 HAs、AGEs 等多元危害物,必须要弄清楚多反应前体共存体系下热加工过程中危
害物间的相互关系,弄清楚针对各个危害物的定向抑制剂或者抑制途径对其他有危害物
的影响,即联动效应。为了能够弄清多反应体系中的这些变化,需要以定量的方式研究
目标反应,因此需要描述这种变化的动力学参数。美拉德反应是一系列连续的平行的反
应,速率常数和活化能等动力学参数,对反映不同美拉德反应步骤有重要作用。当多个
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江南大学博士学位论文
相互关联的前体物质进行反应同时建模时,可以应用多响应动力学建模,其能够同时考
虑不同的反应,这些反应通过共同的反应网络相互联系[37]。
1.3.1 美拉德反应动力学
1.3.1.1 动力学建模的作用
动力学建模可以应用于食品中的化学变化,例如颜色随时间和温度的变化,美拉德
反应中风味行成。如果反应速率和温度依赖性已知,原则上可以预测并控制反应途径危
害物的产生。此外,动力学建模还可以帮助理解化学反应机理。
根据一般速率定律,化学反应速率可以表示为组分 A 浓度随时间 t 的减少:
ꢀ[ꢁ]
ꢀꢂ = −ꢃ[A]ꢄ (1-1)
式中,k 为反应速率常数,n 为反应级数(通常为 0<n<2)。
零级反应:
[A] = [A]ꢅ − ꢃt (1-2)
一级反应:
[A] = [A]ꢅexp(−ꢃt) (1-3)
二级反应:

[ꢁ] =
[ꢁ]ꢇ + ꢃt (1-4)
文献报道中,大多数反应考虑为一级反应。然而,简单动力学方法只是数学拟合过
程,不需要考虑实际机理。如果试图详细解释某一个特定反应,需要提出反应机制,即
多响应建模。多响应动力学建模同时考虑反应物、中间体和产物。美拉德反应涉及复杂
的反应途径,应用多响应建模有助于建立机理模型,确定优势反应路线,及所形成产物
[38]。此外,通过改变反应条件,如温度;添加抗氧化剂等,模型可能发生改变,占优势
的反应路线以及生成的反应产物也会发生转变。总之,多响应动力学的优势在于将初始、
中间和终产物联系起来,能够解释不同反应路径的重要性[39]。
多响应动力学建模对理解化学反应机理具有重要作用,如维生素 C 降解[40]、美拉德
反应中 α-二羰基化合物[41]、丙烯酰胺[42]、CML[43]的生成等。美拉德反应动力学研究目
前虽然针对不同的产物进行了多响应建模,但多数是在简单模拟体系中进行,少数在实
际食品体系研究。缺乏多底物共存条件下不同美拉德反应产物同时生成的联动研究。针
对本文主要研究的两类美拉德反应危害物——HAs 和 AGEs,在接下来的章节进行介绍
目前在模拟体系和实际食品体系中动力学方面的研究现状。
1.3.1.2 HAs 生成动力学
HAs 动力学在模拟体系中的研究主要是单反应体系。如,肌酸酐/苯乙醛混合应体系
在 180°C~210°C 加热时,PhIP 随时间呈线性增加。然而,PhIP 的生成存在滞后时间。
通常在温度升高时减少,210°C 加热时滞后时间约为 13.4 min,活化能为 136.2 kJ/mol[44],
当反应混合物中加入甲醛时,滞后时间缩短为 9.1 min,反应的活化能为 132.2 kJ/mol。
10
第一章 绪论
在丙烯醛/肌酸酐体系中 MeIQx 的生成动力学及丙烯醛/丁烯醛/肌酐/谷氨酰胺混合物反
应体系中 IQ 和 MeIQ 的生成都随反应时间呈线性增加[45]。
此外,已经在液态模拟反应体系(肌酸酐/葡萄糖/二肽/游离氨基酸)[46]和牛肉汁
模拟体系[47]中进行了 HAs 生成动力学研究。体系中 HAs 生成遵循一级反应,PhIP 生成
遵循单分子反应的速率限制步骤,而对于 MeIQx、4,8-DiMeIQx 和 IQx[2],限速步骤可
能是肌酸酐、醛和吡嗪之间的反应[46,47]。此外,速率常数随温度变化的情况符合艾林方
程。Ahn 和 Grün[48]在玻璃试管中加热含有 16%脂肪的碎牛肉,研究 HAs 生成动力学,
观察到 5~10min 的滞后期,HAs 含量比液体模拟反应体系中观察到的含量少 30~40 倍。
此烤肉模拟体系中HAs生成动力学表明,norharman和4,8-DiMeIQx对温度变化更敏感,
而 MeIQx 和 AαC 的温度敏感性较低[48]。Kondjoyan 等人[49]利用一级动力学模型来建立
过热蒸汽加热牛胸最长肌中 IQx、MeIQx、4,8-DiMeIQx 和 PhIP 的动力学方程。
1.3.1.3 AGEs 生成动力学
食品中 CML 含量取决于所采用的原料和加工条件,如时间、温度等。为了控制复
杂反应网络中 CML 的生成,需要对目标反应进行定量研究。对 CML 生成的定量研究,
无论是在食品模拟体系还是在实际食品中都比较少见。等摩尔的赖氨酸与葡萄糖、乳糖
或麦芽糖溶液在 100℃下加热 48 h,由乳糖或麦芽糖生成 CML 的速率高于葡萄糖。乳
糖或葡萄糖和赖氨酸溶解于磷酸盐缓冲液(0.2 M, pH 6.8)中,在 95°C 加热 20 min,乳
糖体系的 CML 浓度比葡萄糖体系的 CML 浓度高 2.2 倍[50]。Nguyen 等人[43]利用多响应
动力学建模,确定了酪蛋白酸钠与葡萄糖或乳糖在 120°C 和 130°C 中性 pH 下加热生成
CML 的动力学模型,认为 CML 不是由还原糖氧化产生的乙二醛生成,而是通过 Amadori
重排产物氧化生成。Sun 等人[27]认为商业灭菌猪肉糜中 CML 和 CEL 生成过程符合零级
反应。
1.3.2 稳定同位素标记研究反应途径
1.3.2.1 稳定同位素标记研究概述
使用稳定同位素标记的有机化合物作为某些目标分子形成的前体或中间体,是阐明
复杂反应途径的有力技术。稳定性同位素标记广泛用于农业、生态学、化学、生物学和
医学的示踪试验[51,52]。常用到的稳定同位素标记物原子有 13C、15N、18O 和 35S 等[53]。在
生物信息学方面,蛋白质的稳定同位素标记是利用核磁共振波谱技术研究蛋白质结构、
相互作用或动力学的重要手段[52]。在食品科学领域,稳定同位素比值测定用于食品溯源、
鉴别食品掺假,此外稳定同位素稀释质谱法检测食品中有害物质也得到迅速发展。美拉
德反应途径研究中,氨基酸或葡萄糖常用的标记原子为 13C 和 15N,Yaylayan 等人[54–57]
在这一领域做了广泛而深入的研究。
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